鹽脅迫對青綠苔草生長及生理特性的影響

任智新， 史建楠， 何佳星， 王 曄*， 范希峰， 李潤枝， 于春欣， 彭 真，高月榮， 段留生*

(1. 北京農學院植物科學技術學院，北京102206；2. 北京市農林科學院草業花卉與景觀生態研究所，北京 100097)

土壤鹽漬化是影響植物生長發育最重要的非生物脅迫之一，對農業生產和人類生活造成了極大的影響[1]。據統計，全球約6%以上的土地(全球土地約8億公頃)受到鹽脅迫的影響[2]，由于灌溉方式不當、肥料施用不合理和工業污染等，鹽漬化土地面積不斷增加，預測到2050年，一半以上的可耕土地將鹽堿化[3]。高鹽度通常是由于土壤中Na+和Cl-1濃度高，導致高滲條件，阻礙植株從土壤中吸收水分和養分[4]，造成植株滲透脅迫、離子脅迫、氧化脅迫、營養不平衡和減少細胞分裂等[5]。

在我國北方，每年的積雪通過施用融雪劑以保障城市安全，同時也對城市生態環境產生了較大影響。目前，融雪劑以氯鹽型用量最大，主要以氯化鈉為主的工業鹽[6]。每年約有75%～90%的融雪劑滯留在沿路的綠化帶中，導致綠地土壤鹽漬化。城市道路的地被植物吸收含鹽的雪水，打破原有的滲透平衡，細胞內滲透壓升高，最終導致植株生理缺水死亡。同時，鹽脅迫阻斷了關鍵酶的活性進而影響植物的氮代謝[7]，使植株葉片面積減小、葉綠體結構破壞、光合能力減弱和營養失衡等[8-9]。因此，明確植物潛在的耐鹽機制，為利用育種和栽培技術提高植物在鹽脅迫下的適應性，對提高農業生產力和改善生態環境具有重要意義[10]。

青綠苔草(Carexleucochlora)屬莎草(Cyperaceae)苔草屬(Carex)，多年生草本植物，具有返青早、色澤好、耐踐踏性強、形態優美等特點，其溫度適應性強，冬季在-26℃條件下能安全越冬，夏季在35℃以上的持續高溫條件下可正常生長[11]，是我國園林綠地中主栽苔草草種之一[12]。目前，關于青綠苔草的研究多集中在種子萌發[13-14]、混播技術[15-16]和基質配比與厚度[12]等，對其抗性的研究較少。在苔草屬的耐鹽性研究中也多集中在與其他地被植物耐鹽性比較上。雷舒涵等[17]通過對7種野生觀賞草種子萌發期耐鹽性評價發現，書帶苔草和云霧苔草耐鹽性綜合評價值較低。張昆等[18]采用不同濃度NaCl處理白穎苔草，確定了其耐鹽閾值為263 mmol·L-1NaCl。陳佳楠等[19]對14種地被植物采用2種海水濃度的脅迫處理，通過生長情況、鹽害指數、鹽害率和細胞膜透性等綜合比較耐鹽性差異研究發現青綠苔草耐鹽性最弱。因此，為了揭示青綠苔草對鹽脅迫的適應性和生理響應機制，本試驗以不同濃度NaCl作為鹽脅迫處理，探討青綠苔草植株生長及生理特性變化，以期為青綠苔草耐鹽生理機制和在鹽漬化土地的適應性及推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為我國園林綠地主栽苔草草種之一‘四季’青綠苔草(Carexleucochlora‘Siji’)(良種編號：國S-SV-CL-006-2010)由北京市農林科學院提供。

1.2 試驗設計

本試驗在北京農學院智能溫室中進行。溫度(晝/夜)為(25±2)℃/(20±2)℃，光周期(晝/夜)為12 h/12 h，光照強度為5 000 Lux，相對濕度為65%～70%。供試材料青綠苔草于2020年6月15日播種于50孔穴盤中，待長出3～4片真葉后，選取長勢一致的幼苗移栽至10 cm×6.5 cm×8 cm(口徑×底徑×高)的營養缽中，每盆1株。培養基質為草炭土∶蛭石(V∶V)=1∶1。培養至2021年6月10日將植株統一修剪高度，5 d后開始用NaCl脅迫處理，鹽處理濃度設置為：0(CK)，50，100，200和300 mmol·L-1，各處理隨機區組排列，每處理36盆。處理開始時，每天澆灌50 mL相應濃度鹽溶液，連續處理3 d，處理開始后每天對盆進行稱重，并用蒸餾水補充因蒸騰而散失的水分,使鹽處理濃度保持恒定。于鹽脅迫后的0，4，8，12，16和20 d進行各項生理指標測定。

1.3 測定指標與方法

1.3.1植株枯葉率 采用觀測計數法對各處理的每盆青綠苔草葉片進行計數，計算每盆葉片50%面積出現干枯癥狀的葉片數占總葉片數的百分比，記為枯葉率。

1.3.2生物量 剪取每盆青綠苔草單株地上部，放入105℃烘箱中殺青30 min，75℃烘干至恒重，稱重記為單株干重。

1.3.3葉片相對含水量、相對電導率和葉綠素含量 采用飽和稱重法[20]測定葉片相對含水量。參照李合生[21]采用電導儀測定葉片相對電導率。采用乙醇浸提法[20]測定葉綠素a和葉綠素b含量。

1.3.4抗氧化酶活性和丙二醛含量測定 稱取葉片0.5 g，加入磷酸緩沖液及少量石英砂，冰浴研磨。4℃冷凍離心20 min，12 000 r·min-1，上清液即為酶液，置于4℃下保存。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性采用氮藍四唑法，過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性采用愈創木酚法，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸顯色法。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2019進行數據整理和分析；試驗數據采用IBM SPSS Statistics 23軟件進行差異顯著性分析(ANOVA，P<0.05)和主成分分析等；用Duncan’s法進行多重比較；采用Origin2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度鹽脅迫對青綠苔草生長的影響

不同濃度鹽脅迫對青綠苔草生長影響不同(圖1)。隨著NaCl濃度升高，青綠苔草生長受到抑制，葉片衰老，枯葉率顯著增加，地上部生物量呈下降趨勢(表1)。NaCl濃度為50 mmol·L-1時，青綠苔草生長、枯葉率和地上部生物量與CK相比差異均不顯著。當NaCl濃度高于100 mmol·L-1時，隨著鹽濃度增加，青綠苔草枯葉率顯著提高，地上部生物量顯著下降。當NaCl處理第8 d時，100，200和300 mmol·L-1濃度處理的青綠苔草葉片開始枯黃。當鹽脅迫第20 d時，100，200和300 mmol·L-1濃度處理的苔草枯葉率比對照分別增加了27.52%，46.24%和92.93%，地上部生物量分別降低了22.36%，45.25%和55.75%。

圖1 不同濃度NaCl脅迫對‘四季’青綠苔草生長的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NaCl on growth of Carex leucochlora ‘Siji’

表1 不同濃度NaCl脅迫對‘四季’青綠苔草枯葉率的影響Table 1 Effect of different concentrations of NaCl on withered leaf rate of Carex leucochlora ‘Siji’

2.2 不同濃度鹽脅迫對青綠苔草葉片相對含水量的影響

青綠苔草葉片相對含水量隨著NaCl濃度的增加和脅迫時間延長呈下降趨勢(圖2)。當NaCl濃度為50 mmol·L-1時，葉片相對含水量與CK差異不顯著。當NaCl處理第4 d時，與對照相比，100，200和300 mmol·L-1濃度處理的青綠苔草葉片相對含水量分別降低了5.44%，10.05%和16.08%。鹽脅迫第8 d后，葉片相對含水量下降迅速，當鹽脅迫第20 d時，100，200和300 mmol·L-1濃度處理的青綠苔草葉片相對含水量比對照分別降低了11.95%，20.95%和31.78%。

圖2 不同濃度NaCl脅迫對‘四季’青綠苔草相對含水量的影響Fig.2 The effect of different concentrations of NaCl stress on the relative water content of Carex leucochlora ‘Siji’注：不同小寫字母表示相同時間的不同鹽梯度處理差異顯著(P<0.05)。下同Note:Different lowercase letters indicate significant differences in different saline treatments of the same time (P<0.05).The same as below

2.3 不同濃度鹽脅迫對青綠苔草葉綠素含量的影響

不同NaCl濃度和鹽脅迫持續時間對青綠苔草葉綠素含量影響不同(圖3)。隨著NaCl濃度升高，青綠苔草葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量降解加劇，葉綠素a/b呈先增高后降低趨勢。與CK相比，NaCl濃度為50 mmol·L-1時，對青綠苔草葉綠素a和總葉綠素含量影響均不顯著；當NaCl濃度高于100 mmol·L-1處理8 d后，青綠苔草葉綠素a、葉綠素b和葉綠素含量下降明顯，當鹽脅迫第20 d時，100，200和300 mmol·L-1濃度處理的青綠苔草與CK相比，葉綠素a含量分別下降了6.03%，27.81%和53.06%，葉綠素b含量分別下降了44.57%，61.01%和66.04%，葉綠素b含量降低幅度高于葉綠素a。葉綠素a/b分別增加了63.20%，77.24%和30.35%。

圖3 不同濃度NaCl脅迫對‘四季’青綠苔草葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of NaCl stress on the total chlorophyll content of chlorophyll in Carex leucochlora ‘Siji’

2.4 不同濃度鹽脅迫對青綠苔草葉片相對電導率和丙二醛含量的影響

青綠苔草葉片相對電導率隨著鹽脅迫時間的延長顯著升高(P<0.05)(圖4)。當NaCl濃度為50 mmol·L-1處理青綠苔草第4 d時，葉片相對電導率與對照相比變化不大；100，200和300 mmol·L-1處理下葉片相對電導率均呈升高趨勢。當鹽脅迫第8 d時，各濃度下青綠苔草葉片相對電導率與對照相比顯著升高(P<0.05)；鹽脅迫持續處理20 d時，各濃度處理葉片相對電導率與對照組相比分別增加了3.53，6.69，16.71和20.83倍。

青綠苔草葉片中丙二醛含量(MDA)隨著NaCl濃度的增加和鹽脅迫時間的延長，呈現上升趨勢(圖4)。NaCl濃度為50 mmol·L-1時，對青綠苔草葉片MDA含量影響不顯著。當NaCl濃度高于100 mmol·L-1時，MDA含量顯著高于對照(P<0.05)。當NaCl處理8 d后，隨著NaCl濃度增加，MDA含量急劇升高，當NaCl處理第20 d時，100，200和300 mmol·L-1濃度處理的青綠苔草葉片MDA含量分別比對照相比增加了86.09%，2.35倍和3.60倍。

圖4 不同濃度NaCl脅迫對‘四季’青綠苔草相對電導率和MDA含量的影響Fig.4 The effect of different concentrations of NaCl stress on the relative conductivity and MDA content of Carex leucochlora ‘Siji’

2.5 不同濃度鹽脅迫對青綠苔草葉片抗氧化酶活性影響

由圖5所示，隨著鹽脅迫時間延長，葉片SOD活性呈先上升后降低趨勢。各濃度NaCl脅迫下的青綠苔草SOD活性均顯著高于對照(P<0.05)。當鹽脅迫第8 d時，不同濃度NaCl處理下SOD活性均達最高，與對照相比分別提高了1.65，2.45，3.57和2.39倍。

POD活性的變化趨勢與SOD活性相似(圖5)。青綠苔草葉片POD活性隨著鹽脅迫時間延長呈現先上升后下降的趨勢。當鹽脅迫第8 d時，不同濃度NaCl處理下的POD活性均有不同程度的上升，與對照相比分別提高了52.38%，76.65%，87.55%和76.83%。當鹽脅迫8 d后，葉片POD活性呈下降趨勢，且隨著NaCl濃度增加，下降越急劇。NaCl濃度為300 mmol·L-1處理第16 d時，POD活性與對照相比差異不顯著，處理第20 d時，植株葉片大量枯黃，POD活性顯著低于對照，推測此時鹽脅迫程度超過青綠苔草耐受能力。

圖5 不同濃度NaCl脅迫對‘四季’青綠苔草葉片抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of NaCl stress on antioxidase activities of Carex leucochlora ‘Siji’

2.6 不同濃度鹽脅迫下各指標主成分分析

對不同濃度NaCl處理下青綠苔草各指標進行主成分分析(圖6)。PC1特征值為5.727，方差貢獻率為72.6%。PC1主要反應植株生長和細胞膜透性，其分別與枯葉率、相對電導率、MDA含量、SOD活性和POD活性抗氧化酶活性含量呈正相關，表明不同濃度NaCl處理后其含量隨鹽分含量的增加而升高；PC1與植株干重、葉綠素和相對含水量呈負相關，表明NaCl濃度增加其含量減少。PC2特征值為1.874，方差貢獻率為23.6%。PC2與電導率、葉綠素含量、相對含水量和抗氧化酶呈正相關，其中與抗氧化酶SOD和POD含量相關度較高。PC2與枯葉率、干重和MDA含量呈負相關。

圖6 不同濃度NaCl處理下各指標主成分分析Fig.6 PCA of each index under different concentrations of salt stress

選擇PC1和PC2作為評價青綠苔草耐鹽性的綜合指標。以Y1和Y2分別代表第1和第2主成分，X1-X8分別表示8個單項生理指標，以各指標的特征向量為系數。可得到兩個綜合指標與原8項單項指標的線性組合方程：

Y1=0.378X1+0.41X2-0.41X3-0.411X4+0.113X5+0.047X6+0.41X7-0.411X8，

Y2=-0.247X1+0.009X2+0.018X3+0.009X4+0.674X5+0.696X6-0.021X7-0.002X8。

將各指標在綜合得分模型中的系數歸一化處理，計算各指標權重，各指標影響順序依次為相對含水量>地上部生物量>相對電導率>葉綠素含量>MDA含量>枯葉率>SOD活性>POD活性(表2)。

表2 初始因子載荷矩陣、特征向量和權重分析Table 2 Initial factor loading matrix,eigenvectors and weight analysis

3 討論

鹽脅迫對植株的影響主要表現在對其生長發育、器官形態建成和生理代謝的抑制作用[22-23]，通常地上部為適應環境變化較根系受到抑制更明顯[18]，主要表現在株高降低、葉片數減少、葉片失水萎蔫、冠幅和生物量顯著下降等[24-25]。因此，鹽脅迫嚴重影響了草坪和地被植物的景觀效果。本研究結果表明，NaCl濃度為50 mmol·L-1時，青綠苔草地上部長勢、地上部生物量和葉片相對含水量與對照差異不顯著。隨著NaCl濃度提高和脅迫時間的延長，植株生長受到抑制，葉片萎蔫，枯葉率明顯增加，地上部生物量和葉片相對含水量顯著下降。這與前人在白穎苔草(Carexrigescens)[18]、狗牙根(Cynodondactylon)[26]、小報春(Primulaforbesii)[24]和湖南稷子(Echinochloafrumentacea)[25]中報道一致。此外，本研究中青綠苔草在50 mmol·L-1NaCl處理下生長受鹽脅迫影響不明顯，說明青綠苔草可能在中度鹽化土(土壤含鹽量0.2%～0.4%)條件下正常生長。

葉綠素是植株光合能力的基礎，其含量高低與光合潛力密切相關，也是逆境條件下衡量葉片功能的重要指標[27]。本研究中，不同濃度NaCl處理對葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量影響一致。與對照相比，在50 mmol·L-1NaCl處理下，葉綠素含量變化不大。在100 mmol·L-1以上NaCl處理第4 d時，葉綠素含量差異不顯著；當處理第8 d時，葉綠素含量顯著降低。說明在低鹽濃度(50 mmol·L-1)或短期高鹽濃度(≥100 mmol·L-1)誘導下，青綠苔草產生了短期的逆境適應機制，來減緩鹽脅迫的生理干擾[18,28]。當高鹽脅迫持續作用，誘導了參與光合作用的重要膜蛋白變性，葉綠素降解酶活性增強，降解葉綠素分子[29]，葉綠體數量減少，同時對葉綠體超微結構產生不利影響，進而降低光合速率，導致植株生長減緩[30]。鹽脅迫對葉綠素b影響強于葉綠素a，在高鹽濃度脅迫20 d時，葉綠素a/b明顯增加，可能與葉綠素b向葉綠素a轉化有關。

細胞膜的透性是衡量膜脂過氧化作用和膜氧化損傷程度的指標[31-32]。本研究結果表明，隨著鹽脅迫濃度增加和脅迫時間的延長，青綠苔草的相對電導率呈上升趨勢，說明鹽脅迫對青綠苔草細胞膜影響較大，這與前人在結縷草[33]和狗牙根[26]中報道一致。MDA是細胞膜通透性和脂質過氧化的產物[31]。本試驗中50 mmol·L-1NaCl脅迫下MDA水平沒有顯著提高，在馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)[34]也有類似的結果。而當NaCl濃度增加，MDA含量顯著提高，可見，高鹽濃度環境導致青綠苔草細胞膜完整性和蛋白質活性受損[35]，進而影響植株正常生長。

本研究對青綠苔草不同濃度鹽脅迫下各指標進行主成分分析，從主成分因子可以看出，PC1對植株生長和細胞膜透性影響較大，相對含水量、地上部生物量、相對電導率、葉綠素含量、MDA含量和枯葉率權重分別為：0.1592，0.1591，0.1590，0.1589，0.1587和0.1473。前人研究表明，植株生物量的變化是其耐鹽能力的綜合體現[18]，以其植株生物量下降50%時的鹽濃度作為該植物的耐鹽閾值[38-39]。本研究以不同NaCl濃度作為自變量建立回歸方程為y=0.000004x2-0.0056x+2.1073(R2=0.985 7)。通過鹽脅迫下生物量的降低50%可以估測青綠苔草對鹽脅迫的臨界濃度為231.29 mmol·L-1。

4 結論

通過研究不同濃度NaCl脅迫下青綠苔草生長發育和生理特性的響應，探討了草坪地被植物青綠苔草耐鹽生理機制和在鹽漬化土壤中適應性。在50 mmol·L-1NaCl脅迫下，青綠苔草可以正常生長，但高鹽濃度(≥100 mmol·L-1)使其生長受到抑制，枯葉率增加，葉片相對含水量、地上部生物量、葉綠素含量、相對電導率不同程度降低，抗氧化酶(SOD和POD)活性呈先增加后降低趨勢。通過主成分分析表明 8個生理指標對青綠苔草耐鹽性的貢獻率為相對含水量>地上部生物量>相對電導率>葉綠素含量>MDA含量>枯葉率>SOD活性>POD活性。青綠苔草在低鹽濃度或短期高鹽脅迫下，表現出一定的耐鹽性，耐鹽閾值為231.29 mmol·L-1。本研究為青綠苔草在鹽漬化土地的栽培和應用提供了理論依據。