淫羊藿種子變溫層積過程中胚形態及生理生化變化

徐寵然， 葛 慧， 賈襲偉， 李 飛， 久西加， 趙 鑫， 張 妍， 陳紅剛,2， 杜 弢,2*

(1.甘肅中醫藥大學藥學院， 甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫藥大學西北中藏藥協同創新中心， 甘肅 蘭州 730000)

淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim.)為小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(EpimediumLinn.)多年生草本植物，全草入藥，是常用中藥之一，其性溫，味辛、甘，入肝、腎二經。《本草綱目》謂其有益氣、堅筋骨、補腰膝、強心力等功效[1]，主治陽萎早泄、腰酸腿痛、四肢麻木、半身不遂、神經衰弱、健忘、耳鳴、目眩等癥[2]。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性物質之一，對骨質疏松、阿爾茲海默病、帕金森、腦缺血、動脈粥樣硬化、風濕病等多種疾病均有顯著改善作用[3]。淫羊藿藥材的市場需求不斷擴大，但因其種子存在休眠現象，發芽率低且生長緩慢[4]，導致其野生資源日漸匱乏，目前已被列為近危植物(IUCN標準)。

種子休眠是指具有生活力但在適宜的環境條件下經過一段時間后仍不能發芽的現象[5]。層積過程中種胚的發育和生理生化的變化是種子休眠解除的重要途徑。變溫層積通過促進胚形態發育、萌發物質的轉化及能量積累從而解除種子休眠，這在北五味子[6]、圓齒野鴉椿[7]等植物種子上已有驗證。在層積過程中，通過營養物質的水解與轉化，促進種胚生長發育，為打破休眠奠定了形態基礎。同時，呼吸途徑相互轉化也是種子休眠解除的關鍵條件，呼吸途徑論指出，種子休眠解除是呼吸代謝糖酵解途徑(EMP)和三羧酸循環(TCA)途徑向磷酸戊糖途徑(PPP)轉化的結果[8]。另外，激素是植物自身合成的具有調節種子休眠和萌發的有機物質。在植物體內已發現生長素類、赤霉素類、細胞分裂素類、脫落酸和乙烯等激素，對植物的生長發育發揮調控作用[9]。

近年來研究發現，巫山淫羊藿(EpimediumwushanenseYing)[10]種子存在胚形態及生理后熟。朝鮮淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)種子在自然層積的條件下種胚發育快，率先完成形態后熟[11]。王晶等[12]研究表明變溫層積處理可加速胚的發育，同時減少胚乳中萌發抑制物質含量，隨著層積時間延長，朝鮮淫羊藿種子胚率和活力顯著增加，變溫層積5個月胚的活力達到95%。同時研究表明淫羊藿種子同樣具有休眠現象[13]，韓偉等[14]研究認為低溫層積淫羊藿種子有利于種子內大分子營養物質降解，促進胚的進一步發育，然而目前對于淫羊藿種子有關變溫層積的研究未見報道，變溫層積對其種胚發育及生理生化特性的影響仍不明確。因此，本研究通過對淫羊藿種子進行變溫層積處理，測定不同層積時間種子胚形態及生理生化物質的動態變化規律，旨在探究淫羊藿種子胚形態變化及生理生化物質之間的內在聯系，為今后研究淫羊藿種子變溫層積提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

淫羊藿種子于2020年7月采于甘肅中醫藥大學和政藥用植物園(35°15′48″ N，103°24′21″ E)，由甘肅中醫藥大學杜弢教授鑒定為淫羊藿種子。采收后揉搓去除外種皮，再過篩剔除癟粒，自然陰干。

1.2 試驗方法

1.2.1種子變溫層積處理 將河沙洗凈過篩(40目)，高壓滅菌鍋滅菌(121℃，30 min)，鋪至距容器底部3～4 cm處，將淫羊藿種子裝入紗布網袋，平鋪于河沙之上，再覆蓋3～4 cm河沙，保證種子處于容器中部，沙子濕度為9%～11%，用保鮮膜封住容器，打孔透氣。第1～90 d將容器放置于室內(20～25℃)，第91～150 d置于4℃冰箱中。每隔30 d取樣一次，樣品置于—80℃冰箱保存，用于生理生化指標測定。

1.2.2種子胚形態及胚率觀測 從各層積時期樣品中分別隨機選取15粒種子，蒸餾水浸泡24 h，OCT膠水常溫包埋10 min，冷凍包埋5 min(-20℃)，Leica-CM1950型恒冷切片機切片(厚0.12 mm)，0.1%固綠醇溶液染色30 s，LeicaDM 500顯微鏡觀察種子形態結構，測量胚長和種子長，并用如下公式計算胚率。

1.2.3種子營養及生理生化指標測定 淀粉含量、可溶性蛋白質含量、可溶性糖含量均采用試劑盒(南京建成)測定，具體操作按試劑盒說明進行。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)活性、赤霉素(GA)含量、吲哚乙酸(IAA)含量、脫落酸(ABA)含量均采用ELISA酶聯免疫法試劑盒(上海欽誠)測定，具體操作按試劑盒說明進行。

1.2.4數據分析 使用SPSS 25.0軟件進行方差及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 淫羊藿種子胚形態、胚率變化

淫羊藿種子存在形態后熟現象，即種子在采收后種胚尚未發育完全，且種子成熟度不一致。在常溫層積過程中由球形胚階段逐漸發育為心形胚階段，低溫層積中種胚繼續發育，最終達到子葉期胚階段(圖1A～1F)。

圖1 淫羊藿種胚形態Fig.1 Embryo morphology of Epimedium brevicornu Maxim.注：A.未層積；B.層積30 d；C.層積60 d；D.層積90 d；E.層積120 d；F.層積150 dNote:A. non stratification;B. stratification 30 d;C. stratification 60 d;D. stratification 90 d;E. stratification 120 d;F. stratification 150 d

胚率在整個層積過程中總體呈上升趨勢(圖2)。常溫層積期間(1～90 d)胚率呈現階梯式增長趨勢，30～60 d期間顯著升高(P<0.05)，胚率在低溫層積(90～150 d)期間顯著升高(P<0.05)，并在層積150 d時達到最大值(73.30%)。

圖2 不同層積時期淫羊藿種子胚率變化Fig.2 Changes of embryo rate of Epimedium brevicornu Maxim. seeds in different stratification periods注：不同小寫字母表示處理時間之間在0.05水平差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示處理時間之間在0.01水平差異顯著(P<0.01)。下同Note：Different lowercase letters indicate that there are significant differences between treatment times at the 0.05 level；Different capital letters indicate that there are significant differences between treatment times at the 0.01 level. The same as below

2.2 營養物質含量的變化

變溫層積過程中，種子內營養物質含量變化顯著(圖3)。可溶性蛋白質含量整體呈上升趨勢，層積150 d時的含量(58.47 mg·g-1)約是處理前(7.22 mg·g-1)的8倍。可溶性蛋白質含量在常溫層積(1～90 d)期間含量顯著升高(P<0.05)，在層積30 d時含量增加量最大，并在90 d時達到最大值(62.53 mg·g-1)，進入低溫層積(90～150 d)后，含量逐漸下降(圖3A)。

隨著層積時間的延長，可溶性糖含量先下降再上升，最后再下降，最終含量(59.34 mg·g-1)較處理前(78.68 mg·g-1)減少約24.58%。可溶性糖含量在層積的前60 d含量下降顯著，60～120 d期間小幅上升后保持平穩，層積的后30 d顯著下降(P<0.05)。

淀粉含量在層積的前30 d顯著下降(P<0.05)，并在30 d時達到最小值(25.77 mg·g-1)，此后逐漸上升，至層積150 d時與初始含量基本持平(圖3B)。

圖3 淫羊藿種子層積過程中營養物質含量變化Fig.3 Changes of nutrient content in seeds of Epimedium brevicornu Maxim. during seed stratification

2.3 呼吸途徑關鍵酶活性變化

在變溫層積過程中，種子內葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)活性整體呈升高趨勢。層積的前30 d內上升顯著(P<0.05)，后期在26.36～30.80 U·gprot-1范圍內波動。層積150 d時G-6-PD活性(28.80 U·gprot-1)較處理前(22.90 U·gprot-1)增加約25.77%(圖4)。

圖4 淫羊藿種子層積過程中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性變化Fig.4 G-6-PD activities in respiratory pathway of Epimedium brevicornu Maxim. seeds during seed stratification

2.4 內源激素含量變化

變溫層積過程中，種子內吲哚乙酸(IAA)含量整體呈上升趨勢。IAA含量在層積的前30 d升高顯著(P<0.05)，后期在20.52～22.36 ng·g-1范圍內小幅波動，并在150 d時達到最大值(22.36 ng·g-1)，較處理前(18.39 ng·g-1)顯著增加約21.63%(圖5 A)。

赤霉素(GA)含量整體呈上升趨勢。GA含量在層積的前90 d內平穩上升，90～120 d期間顯著上升(P<0.05)，并在120 d時達到最大值(109.47 ng·g-1),而后下降，但最終含量(94.89 ng·g-1)依然較處理前(70.29 ng·g-1)顯著增加約35.01%(圖5 B)。

脫落酸(ABA)含量在層積的前30 d迅速升高，30～120 d期間在157.66～172.52 ng·g-1范圍內小幅波動，后顯著下降(P<0.05)(圖5C)。

各內源激素含量間比值在常溫層積(1～90 d)過程中呈下降趨勢，在低溫層積(90～150 d)過程中呈上升趨勢，并始終表現為(GA+IAA)/ABA最大，GA/ABA次之，IAA/ABA明顯小于前兩者，且變幅較小(圖5D)。

圖5 淫羊藿種子層積過程中內源激素含量及其比值的變化Fig.5 Changes of endogenous hormone content and their ratios in seeds of Epimedium brevicornu Maxim. during stratification

2.5 影響胚率的關鍵生理特性分析

層積過程中生理生化指標與胚率的相關分析表明(表1)，除可溶性糖外，其他生理生化指標均與胚率呈正相關關系，其中淀粉(r=0.539)、GA(r=0.615)、IAA(r=0.652)含量與胚率呈顯著正相關關系。

表1 各指標與胚率的相關性分析Table 1 Correlation analysis between each index and embryo rate

3 討論

3.1 后熟與種胚形態的關系

研究表明，休眠分為生理休眠、形態休眠、形態生理休眠、物理休眠和綜合休眠5種休眠類型，其中種胚形態尚未發育完全被稱為形態休眠[17]。老山芹種子存在形態后熟現象，在層積過程中，種胚由心形胚及魚雷胚階段，逐漸發育為子葉胚階段，完成形態后熟過程[18]。本研究結果表明，淫羊藿種子由于種胚尚未發育完全，種子在層積處理前多數為球形胚，具有形態休眠，淫羊藿種胚在變溫層積過程中伸長發育，層積后胚率顯著上升(P<0.05)；胚形態在層積過程中由最初的球形胚發育為心形胚最后形成子葉胚。此結果與鐵筷子[19]和東北刺人參種子[20]在后熟過程種胚的發育過程相似。

3.2 后熟與營養物質轉化的關系

種子在打破休眠的過程中，伴隨著內部營養物質含量的變化。淀粉是植物體內重要的儲藏物質，在維持碳水化合物供需平衡中起到重要作用。可溶性糖是代謝的中間產物，它是由淀粉降解產生，同時又作為呼吸底物被消耗，因此，可溶性糖含量的高低既與淀粉降解的速度有關，又與呼吸消耗的速度有關[21]。可溶性蛋白質是部分細胞結構的基礎物質，在種子生長發育中起到提供氮素的重要作用，為種胚的生長提供物質能量[22]。

在本試驗的變溫層積過程中，淫羊藿種子內淀粉含量先降低后升高，其含量在層積前后無顯著差異，可溶性糖含量下降，可溶性蛋白質含量顯著上升(P<0.05)。在層積的前30 d種子內淀粉含量顯著下降(P<0.05)，說明在變溫層積前期淀粉酶加速對淀粉的分解，種子內代謝活動加強，種子對營養物質的需求量增加，淀粉被轉化成可溶性糖等物質，為種子萌發提供養分。隨著層積天數的增加，種子內的淀粉含量逐漸上升，原因是淫羊藿種子內部儲存能量，為種子萌發提供物質基礎，此結果與薛晨陽對黃精種子的研究結果相似[23]。結果顯示種子內淀粉含量在層積30～150 d期間顯著上升(P<0.05)，種子胚率在此階段同樣呈上升趨勢，且相關性結果表明淀粉含量與胚率呈顯著正相關關系(r=0.539)，說明淀粉積累可能利于胚形態發育，淀粉含量的升高，對種子打破休眠、促進萌發有一定的促進作用。可溶性糖在層積前期含量顯著減少(P<0.05)，是因為種子中呼吸消耗的速度(即種子中被消耗的可溶性糖)大于種子中淀粉降解的速度(即種子中產生的可溶性糖)，可溶性糖分解產生能量，供應給種子維持正常的生理活動，在60～120 d期間，可溶性糖含量小幅上升，表明層積過程中種子內大分子營養物質分解為可溶性糖，為種子萌發做準備，120～150 d含量顯著降低(P<0.05)，可溶性糖逐漸分解，為種子萌發提供能量，假色槭種子在層積過程中可溶性糖含量同樣為先下降再上升最后下降，總體呈降低的變化規律[24]。可溶性蛋白質含量在淫羊藿種子層積前后顯著增加(P<0.05)，種子胚率同樣顯著增加，可能與可溶性蛋白質是部分細胞結構的基礎物質，在種子生長發育過程通過提供氮素，為種胚的生長提供物質能量有關。這與王妮妮等對天女木蘭種子進行室內控制變溫的研究結果一致[25]。

3.3 后熟與呼吸代謝的關系

氧化調節學說認為植物體內有三條最基本的呼吸代謝途徑，具體為糖酵解途徑(EMP)、磷酸戊糖途徑(PPP)、三羧酸循環途徑(TCA)[26]。研究表明種子從休眠到萌發的轉變，同時也是EMP和TCA向PPP的轉變[27]。G-6-PD作為PPP途徑的關鍵限速酶，一定程度上反映了相應呼吸途徑的活化水平。如華重樓種子休眠解除過程中G-6-PD活性提高，促進PPP途徑順利運行,從而促進華重樓種子休眠的解除[28]。楊曉玲等[29]在山楂種子的研究中發現，在種子層積后PPP途徑顯著加強,并促進了非糖物質的氧化分解。本研究結果表明，在層積處理過程中，作為PPP途徑的限速酶，G-6-PD活性顯著升高(P<0.05)，PPP途徑逐漸活化。

3.4 后熟與內源激素的關系

植物激素對種子的休眠萌發具有重要的調節作用，ABA可以誘導種子休眠，它對種子的生理代謝和酶活性有抑制作用，通過影響核酸與有關蛋白質的合成，抑制種子萌發[30]。GA可拮抗ABA的抑制效應，是促進種胚生長，激發種子萌發的物質，通過刺激誘導水解酶，削弱屏障組織(如胚乳或種皮)，誘導種子中貯藏物質的儲備，刺激胚的生長，以促進萌發，從而打破種子休眠[31]。IAA通過調控ABA,GA的合成和傳導影響種子的休眠及萌發[32]。但有關IAA對于種子的休眠與萌發目前尚有不同說法，樹莓種子在打破休眠的過程中IAA含量呈上升趨勢[33]，還有研究表明，IAA具有誘導種子休眠的作用[34]。金銀花種子在層積過程中GA,IAA含量呈升高趨勢，促進休眠的解除[35]。種子休眠的釋放和萌發是多種激素之間相互作用的結果,某一種激素含量和敏感性的變化并不能完成這一復雜的生理過程[36],種子的休眠與萌發不僅與植物內源激素的絕對含量有關，還與各類促生長的激素與抑制生長的激素之間的比例及平衡有關[37]。同時GA與ABA的比值被認為是影響種子休眠的一個重要原因，是植物種子休眠狀態的主要調節因素[38]。GA與ABA比值升高會促進種子萌發、解除種子休眠，反之則抑制萌發[26]。司倩倩等[39]研究發現玉鈴花種子在打破種子休眠過程中GA/ABA，IAA/ABA均呈升高趨勢。張成才等[40]對百蕊草休眠解除的研究也得出類似結論。本研究結果表明，淫羊藿種子在層積過程中GA及IAA含量整體呈現增加趨勢，通過拮抗ABA的抑制作用促進種胚生長發育，ABA含量在后期顯著降低(P<0.05)。GA/ABA,IAA/ABA,(IAA+GA)/ABA的比值均在低溫層積(90～150 d)中顯著升高，同時在此階段種子胚率同樣顯著上升(P<0.05)，說明低溫層積中萌發促進類激素比例的增高，是種子打破休眠、促進萌發的關鍵因素。

4 結論

本研究表明淫羊藿種子存在形態休眠現象；在變溫層積過程中種胚發育與淀粉含量、IAA含量、GA含量呈顯著正相關關系；營養物質的相互轉化為種子打破休眠過程中的呼吸代謝提供能量，并為種子萌發提供物質基礎；促生長類激素與抑制生長類激素比值增大，則促進種胚生長發育。綜上所述，在淫羊藿種子種胚發育過程中，營養物質及呼吸途徑的相互轉化、內源激素的合成與傳導，有效促進了種子形態后熟，為淫羊藿種子變溫層積打破休眠提供理論依據。