姜黃素減輕膿毒癥大鼠肺損傷的作用機制

江端，劉奧杰，凌偉

膿毒癥是宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)，并產(chǎn)生危及生命的器官功能損傷［1］。膿毒癥的發(fā)病因素較多，研究發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌（G-）為主要致病菌，可能與G-中大量的內(nèi)毒素有關(guān)，內(nèi)毒素可激活Toll 樣受體-4放大炎癥信號，導致臟器損傷［2-3］。據(jù)報道，絲裂原細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MEK/ERK）信號通路在膿毒癥所致的急性肺損傷中有重要作用［4］。姜黃素是姜黃屬植物塊莖中的活性成分，具有抗炎、抗氧化、降血脂、降壓、抗菌、解酒護肝、抗腫瘤等藥理活性［5-6］。近幾年，對于姜黃素的抗炎作用研究較多，研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過降低膿毒癥大鼠炎癥水平，保護其肝組織［7］。但姜黃素是否能通過MEK/ERK 信號通路減輕膿毒癥大鼠肺損傷尚不清楚，本研究于2018 年8 月至2019 年4月，采用SD 大鼠體外構(gòu)建膿毒癥動物模型，擬觀察姜黃素對膿毒癥引起肺損傷的保護作用，并初步探究其分子機制，為膿毒癥的防治提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 膿毒癥大鼠模型的建立雄性、健康SD 大鼠75 只購自南京君科生物工程有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2019-0112，使用許可證號SYXK（鄂）2018-0005；3 月齡，體質(zhì)量（200±20）g，SPF 級動物房飼養(yǎng)條件：溫度24～26 ℃，相對濕度40%～60%，每12小時光照黑暗交替，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，用于后續(xù)實驗。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)［8］構(gòu)建膿毒癥大鼠模型，術(shù)后出現(xiàn)豎毛、乏力、眼眶有黏膜、顫抖等，并通過抽簽隨機選取2只造模大鼠病理檢測顯示肺組織明顯損傷，提示建模成功［9］。假手術(shù)組僅開腹取出盲腸再原位放回，不作結(jié)扎、穿孔處理。各組大鼠術(shù)后均進行抗休克（腹腔注射40 mL/kg 乳酸鈉林格液）、抗感染（抗生素）處理，并注意保暖。

1.2 分組與干預(yù)75只雄性SD 大鼠采用隨機數(shù)字表法分為五組：假手術(shù)組（對照），膿毒癥組，姜黃素低、中、高劑量組，每組15只。姜黃素低、中、高劑量組分別于膿毒癥造模術(shù)后24 h 腹腔注射劑量為50、100、200 mg/kg 的姜黃素（上海恒斐生物科技有限公司，純度≥98%，規(guī)格20 mg）［10］；假手術(shù)組和膿毒癥組大鼠以等量生理鹽水替代。觀察期間膿毒癥組，姜黃素低、中、高劑量組分別有5、2、3、1 只大鼠死亡，假手術(shù)組無大鼠死亡，另行造模補齊。

1.3 肺損傷的評價

1.3.1 蘇木精-伊紅（HE）染色 干預(yù)結(jié)束后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠并處死，取肺組織，固定于10%甲醛中，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、切片后，HE（上海經(jīng)科化學科技有限公司）染色，最后中性樹脂封片，顯微鏡（德國萊卡公司）下觀察其肺組織形態(tài)學變化。

1.3.2 肺組織濕干比 按上述方法取肺組織，用濾紙拭去表面血液，稱重即為濕重；再置于烘箱中烘烤72 h至恒重，稱重即為干重，濕干比=濕重/干重。

1.3.3 支氣管灌洗液中總蛋白和白蛋白含量 參照上述方法取肺組織，用生理鹽水灌洗肺組織3次，收集支氣管灌洗液，以2 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清檢測總蛋白含量，采用BCA 蛋白檢測試劑盒（美國Thermo公司）檢測總蛋白的含量。

1.3.4 髓過氧化物酶（MPO）活性 參照上述方法取肺組織，冰上勻漿，以2 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清，采用MPO 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測MPO的含量。

1.4 肺組織細胞凋亡的檢測采用TUNEL 檢測測定肺組織細胞凋亡情況，試劑盒購自美國Promega公司，參照上述方法制備肺組織切片，經(jīng)脫蠟、水化、固定后，添加蛋白酶K 通透組織細胞，室溫下孵育15 min；再次固定后，加入平衡液，濕盒反應(yīng)10 min；加入TUNEL 反應(yīng)混合液，暗濕盒37 ℃下反應(yīng)1 h；滴加檸檬酸鈉緩沖液終止，反應(yīng)15 min；浸入過氧化氫封閉15 min；加入鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶，孵育30 min；進行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染；梯度脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片；顯微鏡下觀察肺組織中凋亡細胞數(shù)，計數(shù)細胞總數(shù)及凋亡細胞數(shù)（正常肺組織細胞核呈藍色，凋亡細胞呈棕色），計算凋亡指數(shù)（凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%）。

1.5 肺組織中白細胞介素（IL）-6、IL-10 及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量的檢測參照上述方法制備肺組織勻漿液，參照酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海群己生物科技有限公司）說明書步驟進行操作，檢測肺組織中IL-6、IL-10及TNF-α的含量。

1.6 肺組織中活化胱天蛋白酶（cleaved-caspase）-3、caspase-9、MEK 及ERK 水平的檢測采用蛋白質(zhì)印跡法檢測肺組織中相關(guān)蛋白表達水平，參照上述方法制備肺組織勻漿液，添加裂解液提取總蛋白，經(jīng)二喹啉甲酸法（BCA）蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。上樣量為30～50 μg，配制10%濃縮膠和5%分離膠，進行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后，進行免疫反應(yīng)，最后暗室中顯影、定影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的表達為內(nèi)參，計算cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、磷酸化p）-MEK、MEK、p-ERK 及ERK 的相對表達量，蛋白一抗購自美國Abcam公司。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計，計量數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布以xˉ±s表示，方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對膿毒癥大鼠肺組織形態(tài)的影響HE染色顯示，假手術(shù)組肺泡結(jié)構(gòu)完整，間隔均勻；膿毒癥組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)明顯擴張，間隔增大，肺泡壁增厚，并有明顯的炎癥細胞浸潤和水腫；姜黃素低、中、高劑量組較假手術(shù)組仍有明顯的病理改變，但較膿毒癥組肺組織損傷明顯減輕，炎癥細胞浸潤現(xiàn)象明顯較少。見圖1。

圖1 姜黃素對膿毒癥大鼠肺組織形態(tài)的影響（蘇木精-伊紅染色×200）

2.2 姜黃素對膿毒癥大鼠肺損傷指標的影響與假手術(shù)組相比，膿毒癥組大鼠肺組織濕干比、MPO含量及肺泡灌洗液中總蛋白量顯著上升（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，姜黃素低、中、高劑量組肺組織濕干比、MPO 含量及肺泡灌洗液中總蛋白量顯著下降（P＜0.05），具有濃度依賴性。見表1。

2.3 姜黃素對膿毒癥大鼠肺組織細胞凋亡的影響膿毒癥組大鼠肺組織凋亡指數(shù)、cleaved-caspase-3及cleaved-caspase-9 水平較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05）；姜黃素低、中、高劑量組凋亡指數(shù)、cleavedcaspase-3 及cleaved-caspase-9 水平較膿毒癥組明顯降低（P＜0.05），具有濃度依賴性。見圖2，表2。

2.4 姜黃素對膿毒癥大鼠肺組織炎性因子水平的影響膿毒癥組大鼠肺組織IL-6、IL-10 及TNF-α 水平較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，姜黃素低、中、高劑量組肺組織IL-6、IL-10 及TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），具有濃度依賴性。見表3。

圖2 姜黃素對膿毒癥大鼠肺組織中凋亡相關(guān)蛋白的影響

表2 姜黃素對膿毒癥大鼠肺組織細胞凋亡指數(shù)和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響/± s

表2 姜黃素對膿毒癥大鼠肺組織細胞凋亡指數(shù)和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響/± s

注：cleaved-caspase為活化胱天蛋白酶。①與假手術(shù)組相比，P＜0.05。②與膿毒癥相比，P＜0.05。③與姜黃素低劑量組相比，P＜0.05。④與姜黃素中劑量組相比，P＜0.05。

組別假手術(shù)組膿毒癥組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組F值P值鼠數(shù)1 5 15 15 15 15細胞凋亡率/%3.86±0.67 19.41±2.58①16.27±2.14②12.36±1.62②③8.59±1.26②③④59.41＜0.001 cleaved-caspase-3 0.13±0.05 0.58±0.13①0.45±0.14②0.33±0.12②③0.21±0.11②③④177.87＜0.001 cleaved-caspase-9 0.24±0.06 0.93±0.15①0.72±0.12②0.58±0.13②③0.39±0.10②③④81.64＜0.001

2.5 姜黃素對膿毒癥大鼠肺組織MEK/ERK 信號通路的影響與假手術(shù)組相比，膿毒癥組大鼠肺組織p-MEK/MEK 和p-ERK/ERK 水平明顯升高（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，姜黃素低、中、高劑量組肺組織中p-MEK/MEK 和p-ERK/ERK 水平明顯降低（P＜0.05），具有劑量依賴性。見圖3，表4。

3 討論

急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是膿毒癥最常見的并發(fā)癥，而急性肺損傷是全身性炎癥反應(yīng)在肺部的表現(xiàn)，主要是炎癥細胞及因子的激活，誘發(fā)了一系列肺毛細血管和肺泡上皮細胞的損傷，改變毛細血管基底膜通透性，肺血屏障功能出現(xiàn)障礙后，大量富含有蛋白質(zhì)的液體進入肺泡或肺間質(zhì)，導致肺水腫［11-12］。MPO 主要是中性粒細胞分泌的血紅蛋白，外界刺激激活中性粒細胞后，會釋放MPO參與宿主反應(yīng)，其高表達提示血管損傷嚴重［13］。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以改善膿毒癥大鼠肺損傷，采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)構(gòu)建膿毒癥大鼠模型后，膿毒癥組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)明顯擴張，間隔增大，肺泡壁增厚，并有明顯的炎癥細胞浸潤和水腫，肺組織濕干比、MPO 含量及肺泡灌洗液中總蛋白量顯著上升，提示膿毒癥大鼠出現(xiàn)明顯的肺損傷：肺水腫、肺毛細血管損及肺高滲透性，與Zolali 等［14］研究相似，而姜黃素可明顯減輕大鼠肺水腫和肺高滲透性，保護其肺組織。

表1 姜黃素對膿毒癥大鼠肺損傷指標的影響/xˉ± s

表3 姜黃素對膿毒癥大鼠肺組織炎性因子水平的影響/± s

表3 姜黃素對膿毒癥大鼠肺組織炎性因子水平的影響/± s

注：IL為白細胞介素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α。①與假手術(shù)組相比，P＜0.05。②與膿毒癥相比，P＜0.05。③與姜黃素低劑量組相比，P＜0.05。④與姜黃素中劑量組相比，P＜0.05。

組別假手術(shù)組膿毒癥組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組F值P值鼠數(shù)15 15 15 15 15 IL-6/（ng/L）72.46±17.62 224.16±35.21①174.73±26.43②132.85±22.18②③101.74±16.52②③④89.34＜0.001 IL-10/（ng/L）6.25±1.49 27.63±5.81①23.57±4.42②17.34±3.19②③12.78±2.27②③④76.31＜0.001 TNF-α/（μg/L）2.15±0.46 7.54±1.34①5.72±1.02②4.28±0.91②③3.07±0.73②③④77.97＜0.001

圖3 姜黃素對膿毒癥大鼠肺組織MEK/ERK信號通路的影響

表4 姜黃素對膿毒癥大鼠肺組織p-MEK/MEK、p-ERK/ERK水平的影響/± s

注：p-MEK/MEK 為磷酸化絲裂原細胞外信號調(diào)節(jié)激酶與絲裂原細胞外信號調(diào)節(jié)激酶比值，p-ERK/ERK 為磷酸化胞外信號調(diào)節(jié)激酶與胞外信號調(diào)節(jié)激酶比值。①與假手術(shù)組相比，P＜0.05。②與膿毒癥相比，P＜0.05。③與姜黃素低劑量組相比，P＜0.05。④與姜黃素中劑量組相比，P＜0.05。

組別假手術(shù)組膿毒癥組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組F值P值鼠數(shù)15 15 15 15 15 p-MEK/MEK 0.48±0.07 1.25±0.14①1.08±0.13②0.81±0.15②③0.62±0.12②③④96.81＜0.001 p-ERK/ERK 0.52±0.09 1.34±0.15①1.16±0.14②0.97±0.13②③0.75±0.11②③④99.78＜0.001

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理后，膿毒癥大鼠肺組織中MEK、ERK 的磷酸化水平顯著下降，提示姜黃素可能通過下調(diào)MEK/ERK 信號通路，改善膿毒癥大鼠肺損傷。促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）家族是體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導通路，幾乎參與所有細胞生物學反應(yīng)，MEK/ERK 是MAPK 家族的重要成員，與細胞凋亡、增殖、分化、炎癥反應(yīng)等過程密切相關(guān)［15-16］。但研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)不同的刺激信號，MEK/ERK 通路對細胞凋亡會有不同的作用；腫瘤細胞中MEK/ERK 激活具有抗凋亡的作用［17］，而急性炎癥中MEK/ERK 則有促凋亡作用，如膿毒癥等［18］。線粒體途徑是細胞凋亡的主要途徑，其中caspase-3 和caspase-9 是關(guān)鍵蛋白分子［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以顯著下調(diào)成熟caspase-3和caspase-9水平，抑制膿毒癥大鼠肺組織細胞的凋亡。臨床研究證實，IL-6、IL-10 及TNF-α 在感染性疾病中有良好的診斷作用［20］。本研究結(jié)果顯示，姜黃素可顯著降低膿毒癥大鼠肺組織中IL-6、IL-10 及TNF-α 水平，提示姜黃素可有效改善膿毒癥大鼠炎癥水平，并緩解其免疫抑制，而減輕肺組織損傷。

綜上所述，姜黃素能夠改善膿毒癥大鼠肺組織病理損傷，減少肺組織細胞的凋亡，減輕炎癥反應(yīng)，下調(diào)MEK/ERK 信號通路而保護肺損傷。但其抑制MEK/ERK通路具體的分子通路還需要深入研究，為姜黃素的臨床應(yīng)用提供理論支持。

（本文圖1見插圖9-1）