丹紅注射液對(duì)感染性休克大鼠肺損傷的保護(hù)作用機(jī)制

王麗娜

感染性休克（SS）是指病原菌及其毒素引起的以低血壓、代謝性酸中毒以及全身炎癥反應(yīng)為特征的病理過(guò)程，給病人健康造成嚴(yán)重威脅［1］。在SS 發(fā)病過(guò)程中，肺是最早受累器官之一，數(shù)據(jù)顯示，約有50%病人伴有肺損傷，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征［2］。病原菌感染后釋放的毒性介質(zhì)如脂多糖等可使免疫系統(tǒng)過(guò)度活化，產(chǎn)生大量的炎性因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6 等。這種破壞性的全身性炎癥反應(yīng)是SS 肺損傷的主要病理過(guò)程，并有可能引起多器官功能障礙綜合征［3］。近年來(lái)研究顯示，丹紅注射液（DHI）除具有活血化瘀的功效之外，尚有良好的抗炎、肺保護(hù)作用［4］。2018 年4 月至2019 年8 月，本研究通過(guò)腹腔注射脂多糖建立大鼠SS 肺損傷模型，觀察DHI 對(duì)SS 大鼠肺損傷的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD 大鼠48 只，周齡范圍為6～8 周，體質(zhì)量范圍為200～240 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2018-0024，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK（冀）2017-0004，于25 ℃、55%相對(duì)濕度、12 h/12 h 光暗周期條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 主要試劑與儀器脂多糖（美國(guó)Sigma 公司），生理鹽水（山東華魯制藥有限公司），DHI（山東丹紅制藥有限公司），地塞米松（浙江仙居仙樂(lè)藥業(yè)有限公司），水合氯醛（上海信裕生物科技有限公司），核因子-κB（p65）［NF-κB（p65）］和κB 抑制因子α（IκBα）免疫組織化學(xué)染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），TNF-α、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。BL-420 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），恒溫烤箱，倒置顯微鏡（Olympus 公司），全自動(dòng)酶標(biāo)免疫分析儀（Biotex公司）。

1.3 大鼠模型制備及分組將所有48 只大鼠于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下給予適應(yīng)性喂養(yǎng)后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、DHI 干預(yù)組和陽(yáng)性對(duì)照組，12只/組。大鼠SS 模型建立方式［5］：腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，暴露右頸總動(dòng)脈，插管連接生物機(jī)能系統(tǒng)（BL-420）以監(jiān)測(cè)血壓。待血壓穩(wěn)定后，模型組、DHI干預(yù)組和陽(yáng)性對(duì)照組經(jīng)腹腔注射脂多糖15 mg/kg，觀察大鼠動(dòng)脈壓直至大鼠達(dá)到休克狀態(tài)（動(dòng)脈壓降低至基礎(chǔ)血壓2/3 以下時(shí)，脈壓小于20 mmHg 為判斷大鼠休克的指標(biāo)），對(duì)照組給予等量的生理鹽水。大鼠SS 模型造模成功后，DHI 干預(yù)組立即經(jīng)腹腔注射DHI 2 mL/kg，陽(yáng)性對(duì)照組經(jīng)腹腔注射1 mL/kg 地塞米松，模型組和對(duì)照組大鼠均予以等體積生理鹽水。

1.4 樣本采集及處理給藥24 h后，以10%水合氯醛5 mL/kg 腹腔注射將大鼠麻醉后固定，放血處死后嚴(yán)格無(wú)菌開胸取肺組織，留取右上肺組織，用生理鹽水沖洗表面血液并吸取表面水分，放入10%甲醛固定液中，常規(guī)包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色后鏡檢及讀片，取左肺組織置于-80 ℃超低溫冰箱凍存待檢。

1.5 大鼠肺濕/干質(zhì)量測(cè)定取各時(shí)間點(diǎn)處死的大鼠肺組織，稱量其濕質(zhì)量（W）后，置烤箱中于70 ℃條件下烘烤24 h 至恒重，稱量并記錄干質(zhì)量（D），計(jì)算肺組織濕干質(zhì)量比（W/D）。

1.6 大鼠肺組織TNF-α、IL-6檢測(cè)制備肺組織勻漿，離心后取上清液，使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)肺組織中TNF-α、IL-6 含量水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織NF-κB 及IκB-α蛋白表達(dá)病變組織以石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片至過(guò)膠玻片上，56 ℃條件下烤片2 h，使用二甲苯連續(xù)脫蠟3次，梯度乙醇脫二甲苯，水洗。采用免疫組織化學(xué)SABC 法染色。采用3%過(guò)氧化氫孵育5 min后，加入5%山羊血清孵育20 min，甩去多余液體，加入適當(dāng)稀釋的兔抗鼠NF-κB（p65）多克隆抗體4 ℃下孵育過(guò)夜，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗后滴加羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗，37 ℃下孵育20 min，PBS沖洗后滴加SABC，37 ℃下孵育30 min。采用DAB 顯色，控制顯色時(shí)間，蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察染色結(jié)果。IκB-α 染色步驟同NF-κB，所用一抗為兔抗鼠IκB-α 多克隆抗體。400 倍鏡下每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，利用Motic Images Advanced 3.2 圖像采集系統(tǒng)分析每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞百分比，陽(yáng)性細(xì)胞的百分比表示陽(yáng)性染色面積占被測(cè)量面積的比值，最后取5 個(gè)視野均值作為測(cè)量值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，以±s 表示計(jì)量資料，多組間比較使用單因素方差分析，多組間的兩兩比較使用SNK 法；計(jì)數(shù)資料采用率表示，行χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為表現(xiàn)對(duì)照組神態(tài)正常，皮毛順滑有光澤，進(jìn)食正常；模型組腹腔注射脂多糖后，大鼠逐步出現(xiàn)活動(dòng)減少，神態(tài)倦怠，皮毛雜亂無(wú)光，進(jìn)食開始減少，反應(yīng)力下降，且上述癥狀有加重趨勢(shì)，表現(xiàn)為躁動(dòng)、寒顫、腹瀉等；DHI 干預(yù)組和陽(yáng)性對(duì)照組在注射脂多糖初若干小時(shí)內(nèi)與模型組具有類似的表現(xiàn)，在給予DHI 和地塞米松干預(yù)后實(shí)驗(yàn)大鼠活動(dòng)增多，躁動(dòng)、寒顫等癥有所減輕。觀察期內(nèi)對(duì)照組大鼠無(wú)一死亡，DHI 干預(yù)組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠死亡率分別為8.33%（1/12），8.33%（1/12），顯著低于模型組的58.33%（7/12）（χ2=10.67，P=0.005）。

2.2 大鼠肺組織病理形態(tài)觀察HE 染色下可見(jiàn)對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡及間質(zhì)無(wú)明顯充血、滲出及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，具有完整的肺泡壁。而模型組鏡下可見(jiàn)肺泡壁破壞嚴(yán)重，肺泡隔增厚，肺間質(zhì)及肺泡腔嚴(yán)重水腫、滲出及出血，大量粒細(xì)胞浸潤(rùn)及透明膜形成。DHI 干預(yù)組肺泡壁多數(shù)完整，肺泡隔較模型組明顯縮窄，腔內(nèi)僅見(jiàn)少許出血、滲出及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。陽(yáng)性對(duì)照組可見(jiàn)肺泡壁多數(shù)完整，肺泡隔較模型組明顯縮窄，腔內(nèi)幾乎無(wú)出血、滲出及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1A。

圖1 各組大鼠肺組織染色圖：A為病理變化（蘇木精-伊紅染色×200）；B為NF-κB（p65）、IκB-α蛋白表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色×200）

2.3 大鼠肺組織W/D 變化對(duì)照組、模型組、DHI干預(yù)組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺組織W/D 分別為4.02±0.37、5.56±0.51、4.72±0.44、4.45±0.46（F=15.72，P＜0.001）；與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織W/D顯著增加（P＜0.05），DHI 干預(yù)組較模型組降低（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組與DHI 干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6檢測(cè)與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-6 含量升高（P＜0.05），DHI干預(yù)組TNF-α、IL-6含量較模型組均下調(diào)（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組TNF-α、IL-6 水平與DHI 干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.5 各組大鼠肺組織細(xì)胞中NF-κB 及IκB-α 蛋白表達(dá)對(duì)照組肺組織NF-κB（p65）、IκB-α 表達(dá)呈弱陽(yáng)性免疫反應(yīng)，陽(yáng)性產(chǎn)物均多分布于氣管黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，NF-κB（p65）在細(xì)胞核中極少見(jiàn)或沒(méi)有，IκB-α 細(xì)胞核中未見(jiàn)。各組NF-κB（p65）、IκB-α陽(yáng)性細(xì)胞百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組NF-κB（p65）、IκB-α呈強(qiáng)陽(yáng)性免疫反應(yīng)，均主要分布于氣管黏膜上皮細(xì)胞、浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，NF-κB（p65）在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均可見(jiàn)，可見(jiàn)明顯的細(xì)胞核易位，IκB-α 見(jiàn)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽(yáng)性細(xì)胞百分比均升高（P＜0.05）。給予DHI干預(yù)后，與模型組比較，肺組織NF-κB（p65）、IκB-α陽(yáng)性反應(yīng)均明顯減弱，陽(yáng)性細(xì)胞百分比均下降（P＜0.05）。陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比較，NF-κB（p65）、IκB-α 均呈弱陽(yáng)性免疫反應(yīng)，陽(yáng)性細(xì)胞百分比均降低（P＜0.05）；與DHI 干預(yù)組比較，NF-κB（p65）、IκBα 陽(yáng)性細(xì)胞百分比均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1B，表2。

表1 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6水平比較/± s

表1 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6水平比較/± s

注：TNF-α 為腫瘤壞死因子-α，IL-6 為白細(xì)胞介素-6，DHI 為丹紅注射液。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組DHI干預(yù)組陽(yáng)性對(duì)照組F值P值鼠數(shù)12 5 11 11 TNF-α/（μg/g）0.23±0.06 0.66±0.08①0.41±0.06②0.38±0.07②52.18＜0.001 IL-6/（ng/g）38.17±6.82 128.04±10.35①66.38±6.20②60.54±5.27②209.02＜0.001

表2 各組大鼠肺組織NF-κB（p65）、IκB-α陽(yáng)性細(xì)胞百分比比較/（%，± s）

表2 各組大鼠肺組織NF-κB（p65）、IκB-α陽(yáng)性細(xì)胞百分比比較/（%，± s）

注：NF-κB（p65）為核因子-κB（P65），IκB-α 為κB 抑制因子α，DHI為丹紅注射液。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組DHI干預(yù)組陽(yáng)性對(duì)照組F值P值鼠數(shù)12 5 11 11 NF-κB（p65）陽(yáng)性細(xì)胞1.92±0.26 7.79±0.71①3.96±0.40②3.90±0.44②226.82＜0.001 IκB-α陽(yáng)性細(xì)胞1.87±0.22 6.96±0.81①3.01±0.38②2.95±0.35②186.03＜0.001

3 討論

SS 亦被稱為膿毒癥休克，是臨床導(dǎo)致肺損傷最常見(jiàn)的病因之一，約占肺損傷發(fā)病原因的40%左右。因此本研究采用常用的腹腔注射脂多糖的方法建立脂多糖導(dǎo)致SS 的大鼠模型，模擬臨床SS 肺損傷的發(fā)生，觀察DHI對(duì)SS肺損傷大鼠的治療作用并探討其作用機(jī)制。地塞米松作為臨床上常用的治療SS肺損傷的藥物之一，因此本研究選用地塞米松作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。本研究中，采用腹腔注射15 mg/kg脂多糖建立大鼠SS肺損傷模型。實(shí)驗(yàn)中觀察到大鼠注射脂多糖后出現(xiàn)一系列SS 癥狀，如躁動(dòng)、寒顫、腹瀉等表現(xiàn)，同時(shí)平均動(dòng)脈壓降至基礎(chǔ)壓2/3以下，與文獻(xiàn)［6-7］報(bào)道相一致。肺組織HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，模型組HE 染色中，肺泡壁破壞，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等符合SS 肺損傷病理表現(xiàn)。另外，模型組肺組織W/D 較對(duì)照組明顯增加，表明注射脂多糖后大鼠有明顯肺水腫表現(xiàn)，結(jié)合上述幾點(diǎn)可見(jiàn)本研究大鼠SS 肺損傷模型構(gòu)建是成功的。

眾多研究顯示，SS 病程中免疫系統(tǒng)激活引起大量的炎性因子釋放，炎性介質(zhì)進(jìn)一步引起肺毛細(xì)血管通透性增加并造成肺損傷［8-9］。本研究中，DHI 可以明顯下調(diào)TNF-α、IL-6 水平，減輕肺組織水腫，改善肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)，且作用與地塞米松相當(dāng)。TNF-α 主要由巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，參與肺組織損傷的炎癥反應(yīng)過(guò)程［10］。IL-6是一種主要由單核一巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子，可促進(jìn)多種炎性因子的生成。李燕等［11］的研究顯示，TNF-α、IL-6等炎癥細(xì)胞因子水平在脂多糖所致的小鼠急性肺損傷模型中明顯升高，其變化與疾病進(jìn)展明顯相關(guān)，這提示DHI 可能通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)揮保護(hù)肺損傷作用。

NF-κB 是一種重要的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，在免疫炎癥相關(guān)信號(hào)通路中居于核心地位［12］。正常生理狀態(tài)下，NF-κB 與IκB 結(jié)合，以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在外源性配體刺激下，IκB-α 先后被磷酸化和泛素化，導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生改變并被降解，NF-κB 與IκB 解離后進(jìn)入細(xì)胞核與靶序列結(jié)合，促進(jìn)TNF-α、IL-6 等炎性因子的表達(dá)，參與肺損傷病理過(guò)程［13-14］。本研究中，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，DHI可以明顯下調(diào)SS 大鼠NF-κB（p65）、IκB-α 的表達(dá)。宋麗娟等［15］的研究顯示，羥基紅花黃色素A 不同劑量組可以不同程度抑制脂多糖致急性肺損傷小鼠NF-κB的激活和NF-κB（p65）核轉(zhuǎn)位，并抑制早期炎性相關(guān)因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的大量釋放，其中羥基紅花黃色素A是DHI中紅花藥理功效的最有效水溶性成分。提示DHI 可能通過(guò)抑制SS 大鼠肺組織NFκB 活化，減少TNF-α、IL-6 等促炎細(xì)胞因子表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)肺損傷作用。

綜上所述，在大鼠脂多糖致SS 肺損傷模型中，DHI 可能通過(guò)抑制大鼠肺組織NF-κB 活化，減少TNF-α、IL-6 等促炎細(xì)胞因子表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)肺損傷作用。

（本文圖1見(jiàn)插圖9-1）