一測多評法同時測定健脾丸中4種有效成分的含量

于文玫

健脾丸是由枳實、炒白術、陳皮與黨參等多味中藥配伍組成的中成藥，具有健脾開胃的功效，臨床用于治療食少便溏，脘腹脹滿，脾胃虛弱［1］。其中，枳實與陳皮發(fā)揮破氣消積，理氣健脾與化痰散痞的功效［2-3］。黨參發(fā)揮養(yǎng)血生津與健脾益肺的功效［4］；炒白術發(fā)揮固表止汗安胎的功效［5-6］。健脾丸的法定檢驗標準收載于《國家藥品標準》中藥成方制劑（第七分冊）。經(jīng)查閱文獻［7-8］，其質量控制均是以枳實與陳皮中主要成分檢測為主，尚未檢索到對健脾丸中白術與黨參質量控制的文獻報道。黨參中特有成分為黨參炔苷，白術中特有成分為白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ、白術內(nèi)酯Ⅲ，通過對此4 種成分含量測定，可以有效控制健脾丸中白術與黨參兩種處方的質量。

一測多評法（QAMS）是利用樣品中某一指標成分作為內(nèi)參物，建立內(nèi)參物與其他待測組分之間的相對校正因子（RCF），再利用RCF 計算其他待測組分的含量［9-11］。QAMS 可以解決中藥對照品制備難度大，穩(wěn)定性差，價格昂貴，不容易獲得的難題，適合于中藥中多成分同時含量測定［12-14］。本研究于2020 年1 月至2020 年7 月采用QAMS 對健 脾丸中4種有效成分進行同時檢測，該方法經(jīng)濟實惠方便快捷，較全面地反映健脾丸的質量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑安捷倫1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；島津LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有二極管陣列檢測器。對照品：黨參炔苷（批號111732）、白術內(nèi)酯Ⅰ（批號111975）、白術內(nèi)酯Ⅱ（批號111976）、白術內(nèi)酯Ⅲ（批號111978）均由中檢院提供；樣品：健脾丸（規(guī)格為每8 丸相當于原生藥3 g，批號191011，181002，190303，200201，仲 景 宛 西 制 藥 公 司；191002，200105，上海華源制藥公司；批號190504，190903，200204，上海寶龍安慶公司；批號200301，蘭州佛慈制藥公司），乙腈、甲醇與冰醋酸均為色譜純，購自德國默克公司，超純水為實驗室自制。

1.2 色譜條件色譜柱為Zorbax SB-C18（250.0 mm×4.6 mm×5μm）；流速為1.0 mL/min；各檢測成分的檢測波長分別為黨參炔苷（270 nm）、白術內(nèi)酯Ⅰ（220 nm）、白術內(nèi)酯Ⅱ（220 nm）和白術內(nèi)酯Ⅲ（270 nm）；柱溫為35 ℃；進樣量為10 μL；流動相為乙腈（A）-水（含0.1%冰醋酸）（B），梯度洗脫程序：0（20%A：80%B），9 min（50%A：50%B），16 min（55%A：45%B），25 min（100%A）。

1.3 對照品溶液的配制稱取各待測成分對照品（黨參炔苷99.37 mg，白術內(nèi)酯Ⅰ15.29 mg，白術內(nèi)酯Ⅱ10.16 mg 與白術內(nèi)酯Ⅲ17.93 mg），轉移至10 mL 容量瓶中，用甲醇充分溶解后定容，作為對照品儲備溶液；量取各對照品儲備溶液1 mL，轉移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容。

1.4 供試品溶液的配制取健脾丸研碎，稱取約2.0 g，轉移至具塞三角瓶中，加入100 mL 甲醇，稱定重量，加熱回流提取1 h，再稱定重量，用甲醇補充損失的重量，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.5 陰性對照溶液的配制按照國家法定檢驗標準中收載的健脾丸處方制法，制備不含白術與不含黨參的陰性樣品，按照“1.4”供試品溶液的配制方法，配制不含白術與不含黨參的陰性樣品溶液。

1.6 回歸方程與RCF 計算本研究以黨參炔苷、白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ與白術內(nèi)酯Ⅲ4 種對照品儲備溶液配制系列標準溶液，進行檢測，以待測成分的質量濃度（x，mg/L）作為橫坐標，以色譜響應值（y）作為縱坐標，以最小二乘法進行線性統(tǒng)計分析，制得回歸曲線方程。并以黨參炔苷為內(nèi)參物，分別計算3種白術內(nèi)酯的RCF。

2 結果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗分別取供試品溶液、對照品溶液及不含白術與不含黨參的陰性樣品溶液，進行檢測。4 種待測成分色譜峰的分離度與對稱性均良好。在不含白術與不含黨參的陰性樣品溶液色譜圖中無其他雜質色譜峰干擾，說明本研究建立色譜條件適用于4種待測成分的檢測。見圖1。

2.2 線性與范圍取“1.3”項下對照品儲備溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，轉移至100 mL 容量瓶中，用甲醇定容，制得標準系列溶液，按照“1.2”項下色譜條件進行檢測，再進行線性回歸分析，標準曲線方程與相關系數(shù)（r）檢測結果見表1。

表1 線性關系考察結果

2.3 重復性試驗取本品（批號191011），按“1.4”項下制備6 份供試品溶液，進行檢測，記錄4 種待測成分的響應值并按照標準曲線方程計算各成分的含量。結果，各成分含量的相對標準差（RSD）（n=6）分別為1.02%、1.15%、0.67%、0.82%，說明本研究建立方法具有良好的重復性。

2.4 穩(wěn)定性試驗取本品（批A號 191011），按B“1.4”項下制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h 進行檢測，記錄4 種待測成分的響應值。結果4 種成分響應值的RSD 分別為0.73%、0.82%、0.66%、0.84%，說明樣品溶液在檢測時間段內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

圖1 高效液相色譜圖：A為對照品溶液；B為供試品溶液；C為不含黨參陰性樣品溶液；D為不含白術陰性樣品溶液

2.5 精密度試驗量取“1.3”項下對照品溶液，按照“1.2”項下色譜條件進行檢測，連續(xù)測定6 次，記錄4種待測成分的響應值，并計算RSD值；結果各成分響應值的RSD 分別為0.56%、0.74%、0.49% 和0.61%，說明精密度良好。

2.6 回收率試驗取樣品（批號191011）6 份，稱取1.0 g，置具塞三角瓶中，加入“1.3”項下對照品貯備溶液500 μL，分別制備供試品溶液，進行檢測，并計算回收率。結果4種待測成分的平均回收率分別為98.16%、97.52%、98.18%、98.13%，其RSD 分別為1.25%、1.05%、1.23%、1.08%。

2.7 RCF和相對保留時間（RRT）的測定

2.7.1 待測組分RCF 計算 按“1.6”項下方法，取“2.2”項下的系列對照品溶液，分別進行檢測，各濃度水平的對照品溶液分別進樣3 次，計算待測成分響應值的平均值，并計算各成分相對黨參炔苷的校正因子。結果見表2。

表2 待測組分相對校正因子

2.7.2 高效液相色譜儀及色譜柱對RCF 的影響本試驗分別考察安捷倫1260、島津LC-20A 高效液相 色 譜 儀 和Zorbax SB-C18（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）、Capcell pak C18（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）、Accucore C18（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）、Thermo ODS C18（250.0 mm×4.6 mm×5 μm）等不同型號色譜柱對RCF 的影響，每個樣品均平行檢測3次，取平均值進行計算，結果見表3。結果表明，不同品牌高效液相色譜儀及色譜柱對RCF無顯著影響。

2.7.3 色譜峰的定位 色譜峰的準確定位是使用QAMS 法的前提，本試驗選用RRT 對各待測成分進行定位。本研究以黨參炔苷為內(nèi)參物，分別計算白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ和白術內(nèi)酯Ⅲ與黨參炔苷的RRT。分別考察各成分RRT 在不同高效液相色譜儀和色譜柱中的重現(xiàn)性。每個樣品均平行進樣3次，取平均值進行計算，結果各成分的RRT 變化非常小。采用RRT 對各成分進行定位更為準確，結果見表4。

表4 不同高效液相色譜儀與色譜柱的相對保留時間檢測結果

2.8 QAMS 與外標法測定結果的比較為了再次驗證本研究建立QAMS 的準確性，本試驗對QAMS與外標法測定結果進行比較。取樣品，按“1.4”項下制備供試品溶液，進樣測定，分別采用QAMS和外標法計算4 種成分的含量，并計算2 種方法測量結果的相對誤差，相對誤差=（QAMS計算值-外標法實測值）/外標法實測值×100%，結果見表5。對2 種方法檢測結果進行t檢驗，結果2種方法檢測含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且相對誤差＜2%。

3 討論

3.1 內(nèi)參物的選擇及色譜峰定位黨參炔苷為黨參中特有成分，性質穩(wěn)定，對照品比較容易獲得，因此選擇黨參炔苷作為內(nèi)參物。QAMS 法應用的前提是各待測成分色譜峰定位必須準確，通常采用RRT對待測成分進行定位。本試驗分別考察了不同品牌的高效液相色譜儀和不同型號的色譜柱對RCF和RRT 的影響，結果表明，采用不同的高效液相色譜儀和不同型號色譜柱，RCF和RRT均非常穩(wěn)定。

3.2 色譜條件的優(yōu)化本試驗對流動相的組成及梯度洗脫條件進行考察，經(jīng)過對甲醇與乙腈兩種有機相比較，發(fā)現(xiàn)甲醇的黏度相對較大，高效液相色譜的柱前壓力較高，容易使色譜柱填料塌陷，損壞色譜柱，并且待測成分黨參炔苷與相鄰成分峰的分離度達不到分度的要求。而乙腈的黏度較低，系統(tǒng)的柱前壓力低，不易損壞色譜柱。通過在水相中加入0.1%乙酸，極大改善了各成分色譜峰的對稱性。利用二極管陣列檢測器的紫外掃描功能，檢測各待測成分的最大響應波長。本研究分別采用各成分最大響應的波長進行檢測，有效提高了對待測成分檢測的靈敏度。

表3 不同高效液相色譜儀及色譜柱的相對校正因子

表5 一測多評法（QAMS）與外標法測得結果比較/（mg/g）

3.3 QAMS 的系統(tǒng)適用性與耐用性本研究利用更換不同品牌的高效液相色譜儀和色譜柱，對所建立方法的耐用性進行考察。通過對安捷倫1260 與島津LC20A 高效液相色譜儀，以及4 根不同型號的液相色譜柱的RRT 與RCF 測定，結果各成分的RRT與RCF 均具有良好的重現(xiàn)性。本研究選擇黨參炔苷作為內(nèi)參物，其主要原因是黨參炔苷性質穩(wěn)定且價廉易得，在節(jié)約檢測成本的同時，可以實現(xiàn)對多種成分進行同時檢測。通過對10 批次的樣品進行分析，驗證了該方法檢測結果與外標法檢測結果無顯著性差異，證明了該方法準確可靠。

本試驗采用QAMS 對健脾丸中黨參炔苷、白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ與白術內(nèi)酯Ⅲ4 種成分進行檢測，結果可靠準確，操作方便且經(jīng)濟實惠，可以對多個有效成分進行同時檢測，與外標法相比節(jié)約了檢驗的時間和成本，為健脾丸的質量控制提供了一種簡便的方法。