環介導等溫擴增技術檢測慢性阻塞性肺疾病伴下呼吸道感染病原菌397例價值研究

溫雅，黃娟，杜焰家，張偉強，曾漢華，朱旭華，鐘子雙

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種常見的慢性氣道炎癥，目前死亡率居全球第4 位。我國COPD的患病率及死亡率呈逐年上升趨勢，其診治為人們和社會帶來沉重的經濟負擔［1］。COPD 病程分為穩定期和急性加重期，下呼吸道感染是導致COPD 急性加重期（AECOPD）發生的重要原因，AECOPD 病人往往需要住院診治，或并發呼吸衰竭、肺性腦病、肺源性心臟病等嚴重并發癥，甚至需要呼吸機輔助通氣治療。據統計分析，COPD 伴下呼吸道感染病原體中細菌感染占約40%～50%，而且不同病程、基礎肺功能的AECOPD 下呼吸道感染的病原菌種類和分布均不同［2］。傳統細菌培養方法檢測時間長，陽性率低，尤其對一些苛養菌的培養條件要求高，未能及時提供感染菌的臨床證據，而環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是通過檢測病原菌核酸的分子生物學方法，能快速、靈敏地檢測出感染病原菌，常在24 h 內就能檢測出相應結果，在呼吸道感染早期階段就能及時提供病原學證據，指導臨床抗生素的使用［3］。LAMP檢測方法近幾年逐漸普及臨床應用［4-6］，但其對COPD伴下呼吸道感染病原菌的檢測情況尚未見有文獻報道。故此，本研究通過回顧性探討LAMP（13 聯）檢測方法對COPD 伴下呼吸道感染的病原菌的臨床應用價值，主要是針對呼吸道細菌和非典型病原體感染的COPD病人。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性選取梅州市人民醫院2018年1 月至2020 年12 月診斷為COPD，臨床診斷伴有急性下呼吸道感染，符合納入與排除標準，臨床癥狀和檢查結果提示伴有下呼吸道感染，且接受抗生素治療的病人共397例，其中入住普通病房，包括呼吸內科（2019 年改名為呼吸與危重癥醫學科）、中醫科、全科醫學科、感染性疾病科，均未接受呼吸機輔助通氣治療的病人共195 例，男177 例，女18 例，年齡（71.73±8.83）歲；入住重癥監護室（ICU），因病情需要接受呼吸機輔助通氣的病人有202 例，男179例，女23例，年齡（73.86±9.31）歲；兩組病人的性別、年齡比較差異無統計學意義（χ2=0.50，P=0.481；t=0.90，P=0.371）。本研究經梅州市人民醫院醫學倫理委員會審核批準（梅市倫審2020-CY-18）。

納入標準：①年齡范圍為18～100 歲；②根據我國COPD 基層治療指南《慢性阻塞性肺疾病基層診療指南（實踐版·2018）》［7］診斷為COPD，臨床癥狀表現為咳嗽、咳黃膿痰、氣促加重，和/或伴有發熱、意識障礙等，檢查結果如影像學提示肺部感染，血清炎癥指標升高，提示伴有下呼吸道細菌或非典型病原體感染的病人；③經病人和/或近親屬同意留取痰液/支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）/支氣管吸出物送檢LAMP（13 聯）檢測和傳統培養檢測；④臨床上均選用敏感抗生素抗感染治療，且治療有效果。排除標準：①合并活動性肺結核、肺癌、嚴重心肺功能障礙、凝血功能障礙的病人；②不同意留取痰液/BALF/支氣管吸出物送檢LAMP（13 聯）檢測和培養檢測的病人；③臨床資料不完整或缺失病人；④痰液/BALF/支氣管吸出物不符合臨床檢驗標準的病人。

1.2 方法檢測標本的獲取：自主咳痰能力尚好的病人入院（入住普通病房和ICU）后24 h內在醫務人員指導下咳出深部痰液；年齡大或咳嗽能力差的病人則經過支氣管鏡吸出深部痰液或經過支氣管肺泡灌洗留取BALF，操作符合《全國臨床檢驗操作規程》［8］，獲取合格標本，并于2 h內送檢。

LAMP（13 聯）檢測方法：所用方法為呼吸道病原菌核酸聯合檢測項目。首先需提取標本里病原菌DNA，病原菌基因組DNA的提取采用博奧生物公司生產的細菌DNA 提取試劑盒，按照廠家推薦的方案進行。通過檢測光密度（OD）260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm，使用Nanodrop 2000 TM 分光光度計（ThermoFisher Scientific 生產）對純化DNA 樣品的質量和濃度進行測量和評估。分離的DNA 保存在-20 ℃，待進一步使用。采用呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒（博奧生物公司，中國北京）按照說明書，采用等溫擴增法和微流控芯片法相結合的方法，對病原菌進行LAMP檢測。采用呼吸道病原菌核酸檢測軟件對檢測結果進行可視化分析。檢測到13 種檢測細菌病原體：肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、結核分枝桿菌復合群。

傳統培養方法：按照臨床常規細菌/真菌培養操作標準，標本被接種在已處理的培養皿，經孵化35 ℃恒溫培養箱，細菌檢測使用VITEK2 BioMerieux（法國）自動細菌分析儀，真菌檢測使用真菌分析儀。

1.3 統計學方法應用SPSS 23.0 軟件進行統計，均以P＜0.05 為差異有統計學意義。其中計量資料以± s表示，采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以例數或構成比表示，采用χ2檢驗，配對樣本間率的比較采用配對χ2檢驗；一致性檢驗采用Kappa 檢驗，Kappa≥0.75時表示兩者的一致性較好，0.40≤Kappa＜0.75 時一致性一般，Kappa＜0.40 時表示兩者的一致性較差。以統計學定義計算LAMP檢測方法的靈敏度、特異度。

2 結果

2.1 感染病原菌LAMP 方法與傳統培養結果的比較入住普通病房和ICU 的COPD 伴下呼吸道感染的LAMP 方法檢測陽性率分別為45.13%、47.03%，均高于傳統培養方法陽性率分別為9.74%、16.83%（χ2=9.72、9.99，P＜0.001）。結合數據看，LAMP 方法陽性檢出率均偏高，提示有一定誤差。ICU 病房與普通病房LAMP檢測陽性率比較差異無統計學意義（χ2=1.44，P=0.704），ICU 病房傳統培養結果陽性率高于普通病房（χ2=4.04，P=0.038）。詳見表1，2。

表1 普通病房COPD 195例感染病原菌LAMP與傳統培養結果/例（%）

表2 ICU病房COPD 202例感染病原菌LAMP與傳統培養結果/例（%）

2.2 LAMP 方法的靈敏度和特異度以傳統培養結果為標準，LAMP 方法對普通病房和ICU 病房的COPD 病人感染病原菌檢測的靈敏度分別為78.95%（15/19）、85.29%（29/34），特異度分別為58.52%（103/176）、60.71%（102/168）。具體例數見表1，2。

2.3 不同標本的LAMP 方法檢測結果普通病房COPD 病人共收集180 份痰液、16 份BALF（共計196份標本），其中痰液的陽性率為47.22%，BALF 的陽性率為25.00%，兩者比較差異無統計學意義（P＞0.05）；ICU 病房COPD 病人共收集199 份痰液，4 份BALF（共計203 份標本），其中痰液的陽性率為47.73%，BALF 的陽性率為25.00%，兩者比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 普通病房和ICU COPD 病人感染病原菌LAMP檢測結果的比較根據LAMP（13聯）檢測結果，入住普通病房的COPD 伴下呼吸道感染病人的病原菌排在前三名為流感嗜血桿菌34例（17.44%）、耐甲氧西林葡萄球菌25例（12.82%）、銅綠假單胞菌13 例（6.67%）、肺炎鏈球菌13 例（6.67%）；入住ICU的COPD 病人感染的病原菌排在前三名的為耐甲氧西林葡萄球菌43 例（21.29%）、流感嗜血桿菌14 例（6.93%）、肺炎鏈球菌13 例（6.44%）。其中，ICU 病房病人的耐甲氧西林葡萄球菌陽性率高于普通病房（P＜0.05），普通病房病人中流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌陽性率高于ICU病房（P＜0.05）。見表4。

表3 普通病房/ICU病房COPD病人不同標本感染病原菌LAMP檢測結果比較/份（%）

2.5 不同病房COPD 感染病原菌培養結果分布特點普通病房和ICU 的COPD 伴下呼吸道感染的病原菌種類、例數和構成比，均以銅綠假單胞菌居首位，其次是肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌。除了常見菌株外，還有較少見的產氣腸桿菌、紋帶棒狀桿菌、葡萄牙棒孢酵母，真菌主要有白絲酵母菌、曲霉菌。見表5。

2.6 LAMP（13 聯）檢測方法與傳統培養方法的一致性分析普通病房病人中銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌的Kappa 值分別為0.62、0.59；ICU 病房病人中銅綠假單胞、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌的Kappa值分別為0.87、0.76、0.58。見表6，7。

2.7 COPD 病人感染病原菌LAMP 檢測與培養陽性結果不相符病例LAMP 方法與傳統培養方法陽性結果大多數為一致，僅有8 份病例存在不一致情況。分析可能原因：培養陽性的病原菌不是LAMP檢測范圍的病原菌，且非典型病原體未能經過傳統培養方法獲取，可能存在混合感染可能；而有2份病例標本LAMP 檢測為肺炎克雷伯菌，培養卻為銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌，存在病原菌在檢測過程中穩定性不同的原因，需要進一步探討。見表8。

表4 普通病房和ICU COPD病人感染病原菌LAMP檢測結果比較/例（%）

3 討論

COPD 是常見的慢性氣道炎癥，是一種不可逆的但可以治療和預防的慢性呼吸道疾病。吸煙和空氣污染導致COPD 發生的重要病因，我們國家吸煙人口基數大，重工業行業正在不斷發展強大中，COPD 患病率也在逐年上升［9］。隨著醫學研究的深入，進一步探究COPD 的發病機制及轉化傾向，2021年COPD 全球創議（global initiative for chronic obstructive lung disease，GOLD）提出了COPD 與肺癌的發生密切相關［10］。有研究證實了COPD 病人中肺部微生物組介導的炎癥反應是導致肺癌發生的重要原因［11-12］，細菌感染也是導致COPD 病情加重、肺功能進一步下降的重要原因。所以，研究COPD 呼吸道感染的病原菌分布特點不僅能為COPD 病人提供治療的臨床依據，更能延緩疾病病程發展的速度，改善病人的預后情況，盡量避免肺癌甚至更多嚴重合并癥的發生。

表5 不同病房COPD感染病原菌培養結果分布特點/例（%）

表6 普通病房COPD病人感染病原菌LAMP和傳統培養結果的一致性分析/例

表7 ICU病房COPD病人感染病原菌LAMP和傳統培養結果的一致性分析/例

隨著分子生物學技術的發展，呼吸道感染病原菌不僅僅只是通過傳統培養方法獲取，況且傳統培養方法往往是耗時長、培養條件要求苛刻，尤其對于一些入院前已經使用過抗生素的病人，經常得到培養陰性的結果，未能及時指導抗生素的選用。對于COPD 伴下呼吸道感染的病人，現臨床上通過檢測痰液標本病原菌核酸和血清學抗原/抗體的方法，能夠快捷有效地提供感染病原菌的證據。本研究采用的LAMP 檢測方法是一種新型的核酸擴增方法，LAMP 方法在病原學檢測的應用價值已得到肯定，檢測范圍包括病毒、細菌、寄生蟲等，其衍生出來的分子生物學檢測方法也在不斷更新中［13-15］。此項檢查項目在該院的醫囑項目為“呼吸道病原菌核酸聯合檢測”，即使用呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒，通過檢測病原菌DNA 的方法檢測出13 種病原菌。研究對象選擇為入住不同病房的COPD 病人，原因是本研究是回顧性分析，病人肺功能檢查資料不齊，未能從COPD 的肺功能等級角度分析，而是否使用呼吸機輔助通氣取決于COPD 病人的病情嚴重程度，伴有下呼吸道感染的致病菌的分布特點存在不同，分析結果可以顯示不同病情程度的COPD 病人伴有下呼吸道感染病原菌的分布特點，對臨床診療具有相應價值。從統計結果看出，普通病房和ICU 病房的COPD 病人通過LAMP（13 聯）方法檢測的病原菌的陽性率分別是45.13%、47.03%，均以單一感染為主，高于傳統培養方法（P＜0.001），這跟國內的相關研究［5，16-17］結果基本相符。

檢測標本采用痰液、BALF、支氣管吸出物，以痰液為主，痰液及BALF的LAMP方法檢測陽性率均差異無統計學意義，而既往的研究顯示痰液的陽性率比BALF 的高［5］，因本研究采用回顧性分析，標本的數量差異較大，所以，不同標本的LAMP檢測結果仍須進一步研究探討，本課題組正在進行后續的BALF 呼吸道病原菌核酸檢測價值的研究中。普通病房和ICU 的COPD 病人的傳統培養陽性率分別是9.74%、16.83%（P＜0.05），究其原因為：傳統培養陽性率低的原因有該院是地方三級甲等醫院，病人在入院前已經使用抗生素治療；其中入住ICU 的COPD 病人伴有重癥呼吸道感染，病人缺失咳嗽、咳痰能力，病情需要無創/有創通氣治療，或者存在呼吸機相關感染的情況，常規采用床邊纖維支氣管鏡獲得肺部深部痰液，導致ICU 病房的傳統培養方法結果的陽性率高于普通病房。

表8 COPD病人感染病原菌LAMP檢測與傳統培養陽性結果不相符病例

根據LAMP 檢測結果，入住普通病房的COPD伴下呼吸道感染的病人的病原菌排在前三名為流感嗜血桿菌34 例（17.44%）、耐甲氧西林葡萄球菌25 例（12.82%）、銅綠假單胞菌13 例（6.67%）、肺炎鏈球菌13例（6.67%）；而入住ICU的COPD病人感染的病原菌排在前三名的為耐甲氧西林葡萄球菌43例（21.29%）、流感嗜血桿菌14例（6.93%）、肺炎鏈球菌13 例（6.44%）。入住普通病房的COPD 病人的病情較輕，以社區輕癥感染為主，流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌為主，與國內外流行病學調查［18］結果相符，但國內缺少多中心臨床研究證據。其中流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌的培養例數為1、0例，因為流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌屬于導致人類呼吸道感染常見的苛養菌，在普通的培養環境不能生長，需要在培養皿中添加特殊的營養物質［19］，LAMP 檢測方法對于這種苛養菌的檢測具有快速靈敏、經濟有效的優勢，彌補了傳統培養對一些苛養菌不敏感的不足，能夠及時獲得感染致病菌的證據，指導臨床用藥。普通病房COPD 病人經LAMP方法檢測出有肺炎衣原體、嗜肺軍團菌，這兩種非典型病原體很難通過傳統培養方法檢測出，經常通過血清學方法檢測出，但血清學檢查經常有滯后現象，國內已有研究顯示LAMP 方法在檢測非典型病原體感染方面具有很大優勢［20-21］，本研究結果也顯示LAMP方法能夠檢測出呼吸道致病性非典型病原體。入住ICU病房的病人中可見耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）陽性率高（P＜0.05），高于普通病房，過去的一些臨床研究顯示COPD 常見的感染病原菌以革蘭陰性菌為主，但是因COPD 呼吸道免疫防御能力的下降、長期吸入或全身使用糖皮質激素、反復住院使用廣譜抗生素、合并院內感染，入住ICU 的COPD 常常伴有肺部重癥感染，導致條件致病菌MRSA 感染的比例上升，甚至還有一些社區感染的情況發生［22-25］，本研究顯示普通病房的COPD伴下呼吸道感染菌中MRSA 也位居前列，國外有臨床研究顯示COPD 是MRSA 感染的獨立危險因素［26］，但是，MRSA 感染與COPD 的關系仍需更多的臨床研究進一步探討。從上述結果顯示，LAMP（13 聯）涵蓋了COPD呼吸道感染最常見的致病菌，對COPD伴下呼吸道感染病原菌的檢測具有靈敏、快捷、有效的優點。

以傳統培養結果為標準，LAMP 方法對普通病房和ICU 病房的COPD 病人感染病原菌檢測的靈敏度分別為78.95%、85.29%，特異度分別為58.52%、60.71%，LAMP 方法對感染病原菌的檢測有比較好的靈敏度，但是因為傳統培養結果的陽性率低，不同標本的檢測結果有差異，導致特異度低的結果，所以本研究與國內相關研究一樣采用一致性檢驗即Kappa 檢驗。經LAMP 方法檢出銅綠假單胞菌與傳統培養檢測結果的一致性最高，Kappa 值為0.87，具有較好的一致性，鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌的Kappa 值為0.76、0.58，跟該院LAMP 技術相關研究及國內一些研究結果相符合［5，27］，但由于研究人群的不同，呼吸道感染致病菌菌種也有不同，根據既往的研究顯示，以痰培養結果統計分析，該院COPD 病人伴有呼吸道感染致病菌以革蘭陰性菌為主，銅綠假單胞菌居首位，前五名的還有鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌［28］，因上文提到的傳統培養方法對苛養菌和非典型病原體培養困難，統計結果可能會偏向容易培養出的致病菌，這也側面說明了LAMP 方法可以檢測出COPD 病人的呼吸道感染致病菌，與痰培養結果有比較好的一致性，彌足了傳統培養方法的不足，有效獲得COPD 伴呼吸道感染病原菌的證據，指導臨床治療。

此外，此研究有8份病例存在不一致情況，分析可能原因：培養陽性的病原菌不是LAMP 檢測范圍的病原菌，特別是以真菌為主，且非典型病原體未能經過傳統培養方法獲取，可能存在混合感染可能；而有2 份病例標本LAMP 檢測為肺炎克雷伯菌，培養卻為銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌，存在病原菌在檢測過程中穩定性不同的原因，需要進一步探討。

綜上所述，LAMP方法在COPD人群中伴有下呼吸道感染病原菌的檢測方面具有靈敏、快捷的優勢，尤其是對于難以培養出的苛養菌和非典型病原體的靈敏度高，能及時為COPD 病人的治療提供臨床依據，具有非常重要的臨床意義，應該普及臨床應用。我們課題組主要是針對LAMP 檢測方法對COPD 伴急性下呼吸道感染病原菌應用價值研究，通過上述結果可以分析該院LAMP檢測方法的運用狀況，分析不同呼吸道標本的檢測情況，我們也正在進行BALF 呼吸道病原菌核酸檢測價值的研究。本研究也有不足之處，比如樣本量較少，因回顧性分析缺失COPD 合并結核分枝桿菌感染的資料，COPD 伴下呼吸道感染病原體還包括一些不常見的菌群或真菌或病毒感染，需要聯合其他檢測方法。雖然LAMP 方法目前在臨床應用上比較廣泛，但仍需要更多的臨床研究去探討其臨床應用價值，促進分子生物學檢測技術不斷更新及改進，為病人的臨床診治帶來更多益處。