τ蛋白、β淀粉樣蛋白、視錐蛋白樣蛋白-1與阿爾茨海默病病人認知功能障礙的相關性研究

穆斌，李艷麗，王杰，胡金雅，孫志華

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種以進行性認知功能障礙和行為障礙為主的中樞神經系統退行性病變［1］。在我國65 歲以上的老年人中，AD 的患病率為3%左右［2］。AD 起病隱匿，早期癥狀較輕且難以發現。在中晚期，進行性智力下降，生活能力喪失，藥物干預效果差，其早期診斷意義重大［3］。研究表明，AD 可能與許多影響因素有關，如神經炎癥反應、遺傳易感性、基因突變、代謝紊亂等［4］。輕度認知功能損害（mild cognitive impairment，MCI）是指認知功能輕度進行性改變或損害，這是癡呆前階段，隨著時間的流逝和疾病的發展，癥狀將逐漸惡化［5］。鈣離子（Ca2+）是重要的第二信使，參與各種生理和病理生理過程。視錐蛋白樣蛋白-1（trypsin-like protein-1，VILIP-1）可以通過影響神經元細胞的Ca2+穩態來反映神經元損傷，這可能是AD 潛在的體液生物學標志。隨著研究的逐漸深入，發現β 淀粉樣蛋白（βamyloid protein，β-AP）和τ 蛋白在AD 的發生和發展中起著主導作用［6-7］。國內外文獻報道主要集中于AD 病人腦脊液中β 淀粉樣蛋白和τ 蛋白水平的研究，盡管腦脊液中蛋白質的檢測更加準確和特異性，并且血清標本的特異性不如腦脊液中的蛋白質，但是從腦脊液中獲取材料更加困難，并且存在一定的風險［8］。血清標本的收集方便，快捷，易于接受且高度安全，這使得檢測血清中的生物標志特別重要［9］。目前尚無明確統一的診斷AD 的血清學標志物，本研究將聯合檢測τ 蛋白、β-AP、VILIP-1 水平，探討其與老年AD 病人認知功能障礙的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料前瞻性選取2020 年1—7 月在河北中石油中心醫院治療的老年AD 病人100 例（AD組），其中男性58 例，女性42 例；年齡（75.50±4.30）歲，范圍為65～81 歲；體質量指數（22.01±2.11）kg/m2，范圍為19.70～24.33 kg/m2；學歷程度：小學55例，初中或高中38 例，大學及以上7 例；同時選取該院體檢健康者50 例作為對照組，其中男性32 例，女性18 例；年齡（74.70±4.55）歲，范圍為65～83 歲；體質量指數（21.94±2.08）kg/m2，范圍為19.60～24.20 kg/m2；學歷程度：小學28 例，初中或高中19 例，大學及以上3 例。AD 組和對照組受試者性別、年齡、體質量指數、學歷程度比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準：①年齡≥65 歲；②診斷符合美國國立老化研究所與阿爾茨海默病協會診斷中的標準［10］；③初治病人；④病人及近親屬知情同意。排除標準：①有其他導致認知功能障礙的疾??；②有顱腦創傷、手術史；③近期有利尿劑、卡馬西平等藥物服用史；④有藥物成癮性者。本研究獲得河北中石油中心醫院倫理委員會批準（KYLL-2020-14）。

1.2 觀察指標及測評方法（1）血清τ 蛋白、β-AP、VILIP-1 水平。早晨7∶00 至8∶00 在空腹中攝取3 mL肘靜脈血，并將其放入裝有檸檬酸鈉的抗凝真空管中。以3 500 r/min（離心半徑13.5 cm）的速度離心10 min，留取上清液置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存。酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測β-AP，τ 蛋白和VILIP-1 水平。將收集到的血清標本加入到樣品孔中，按要求設置空白組與對照組，加入后，在37 ℃下孵育半個小時，除了空白孔外，向其余各孔加入酶標記的試劑，重復孵育和洗滌，添加顯色劑，然后在黑暗中于37 ℃顯色15 min后添加終止溶液。在450 nm 波長處處使用352 型酶標儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS 公司）測量每個孔的吸光度值。繪制標準曲線，將測得的每個孔的吸光度代入公式，求得樣品濃度。（2）采用簡明精神狀態量表（MMSE）評估病人認知功能［11］，該量表評估內容包括定向力、注意力和計算力、記憶力，回憶能力、語言能力等方面，總分30分，分數越低，則認知功能受損越嚴重，其中大學及以上＜23 分，初中或高中＜22分，小學＜20分判斷為認知障礙。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統計。符合正態分布計量資料采用± s表示，組間比較使用兩獨立樣本t 檢驗；計數資料采用頻數或百分比表示，組間比較使用χ2檢驗；相關性采用Pearson 相關性分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清τ 蛋白、β-AP、VILIP-1 比較AD 組組血清τ 蛋白、β-AP、VILIP-1 高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組血清τ蛋白、β-AP、VILIP-1比較/± s

表1 兩組血清τ蛋白、β-AP、VILIP-1比較/± s

注：β-AP 為β 淀粉樣蛋白，VILIP-1 為視錐蛋白樣蛋白-1，AD 為阿爾茨海默病。

組別對照組AD組t值P值例數50 100 τ蛋白/（pg/L）19.01±5.03 24.40±5.55 5.78＜0.001 β-AP/（ng/L）130.32±32.15 210.22±44.43 12.57＜0.001 VILIP-1/（ng/L）3.02±0.95 8.11±1.82 22.50＜0.001

2.2 AD 病人中兩亞組一般資料分析100 例AD病人中，有47 例癡呆（癡呆亞組），53 例MCI 病人（MCI 亞組）。兩組病人性別、年齡、體質量指數、學歷程度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；AD 癡呆病人MMSE評分低于MCI病人（P＜0.05）。見表2。

2.3 AD 病人中兩亞組血清τ 蛋白、β-AP、VILIP-1比較AD 癡呆病人血清τ 蛋白、β-AP、VILIP-1 高于MCI病人（P＜0.05），見表3。

2.4 相關性分析經Pearson 相關性分析，血清τ蛋白、β-AP、VILIP-1 與MMSE 評分呈負相關（r=-0.54、-0.33、-0.51，P＜0.05），可見隨AD 病人認知功能障礙加重，血清τ蛋白、β-AP、VILIP-1水平明顯升高。

表2 阿爾茨海默病兩亞組病人一般資料比較

表3 阿爾茨海默病兩亞組病人血清τ蛋白、β-AP、VILIP-1比較/± s

表3 阿爾茨海默病兩亞組病人血清τ蛋白、β-AP、VILIP-1比較/± s

注：β-AP為β淀粉樣蛋白，VILIP-1為視錐蛋白樣蛋白-1，MCI為輕度認知功能損害。

組別MCI癡呆t值P值例數53 47 τ蛋白/（pg/L）21.37±4.10 27.82±3.82 8.11＜0.001 β-AP/（ng/L）183.47±44.19 240.38±37.32 6.91＜0.001 VILIP-1/（ng/L）6.43±1.44 10.01±1.90 10.69＜0.001

3 討論

MCI 是AD 的早期階段，這是介于正常人與AD癡呆之間的認知障礙。目前有很多關于AD 病人腦脊液中β-AP 和τ 蛋白的定量研究，目前國內外對于認知障礙的研究樣本來源多集中于腦脊液方向，在血液生物學指標的研究上開展相對較少［12-13］，而血液學指標獲取相對便捷，更具有研究價值。

τ 蛋白過度磷酸化可使神經原纖維纏結，引發神經元結構及功能發生改變［14］。β-AP 會加劇機體內氧化應激反應程度，導致神經細胞功能紊亂，導致神經細胞凋亡與突觸的大量丟失，因而影響神經功能［15-16］。研究結果表明，AD 癡呆病人血清τ 蛋白顯著較對照組高。分析原因是τ蛋白的過度磷酸化參與了AD 的發作。τ 蛋白能夠調節微管蛋白向微管聚合的速度和程度，減少微管的崩解，維持微管的結構和功能的穩定性以及參與神經軸突中營養的運輸。磷酸化的水平決定了τ 蛋白的生物學功能。由于各種原因，τ 蛋白過度表達，被釋放進入血液循環，降低微管的穩定性和生物活性。最終導致信號傳遞障礙，軸突運輸障礙，突觸功能退化，導致神經元死亡或凋亡。病人出現了一定程度的認知障礙，患有認知功能減退的AD 病人癡呆病人血清中τ蛋白高于MCI病人。

在正常生理條件下，人腦組織僅少量表達β-AP，但在某些病理條件下，β-AP 的清除過程受到阻礙，導致其沉積，隨之進入血液循環，大量β-AP可損傷神經，導致微循環障礙，使老年病人神經元變性和死亡，引發認知功能障礙［17］。研究表明，β-AP 的大量釋放會影響磷脂酰醇3激酶的活性引起認知障礙。在這項研究中，AD 癡呆病人血清β-AP 高于對照組，AD癡呆病人血清β-AP高于MCI病人。

AD 的發生是許多因素的結果，AD 作為一種神經退行性疾病，以進行性記憶障礙和認知能力下降為早期表現。MMSE 量表具有良好的信度和效度，目前被認為是衡量認知功能的良好量表之一。國內外許多有關老年人認知功能和癡呆的研究都采用這種量表［18］。本研究結果顯示，AD 癡呆病人MMSE 評分低于MCI 病人。血清τ 蛋白、β-AP 與MMSE評分呈負相關，可作為預測AD病人發生認知功能障礙的參考指標。

在AD 的發病機制中，存在Ca2+穩態和Ca2+信號異常［19］。Ca2+是中樞神經系統中重要的第二信使，中樞神經系統內外的信號轉導與Ca2+密切相關，Ca2+參與神經遞質傳輸、神經元之間的信號轉導等［20］。從功能上講，鈣調蛋白結合肽（CBP）可以分為兩類：鈣緩沖蛋白和神經元鈣傳感器（NCS）。前者包括白蛋白和鈣結合蛋白，其中VILIP-1 被包括在NCS 中。VILIP-1 的構象在與Ca2+結合后發生改變，并且與細胞器或靶蛋白的細胞膜相互作用，以影響細胞信號的傳遞［21］。目前的研究結果表明，NCS 與AD 的病理生理過程有關，并且在中樞神經系統突觸之間的神經遞質的傳遞、細胞內外信息的傳遞、細胞代謝、基因表達等方面起作用。研究發現，VILIP-1在皮質的錐體和非錐體細胞中廣泛表達。VILIP-1 的mRNA 廣泛分布在大腦中，它分布在除尾狀核以外的幾乎大腦的每個區域，并在海馬錐體細胞和粒狀細胞的樹突中表達，表明其樹突功能起特定作用。由于VILIP-1 在皮質和海馬中表達，因此由Ca2+介導的神經毒性在AD 的病理生理過程中起著至關重要的作用。但目前尚未有關于VILIP-1 與AD 病人認知功能之間的關系研究。

本研究檢測了AD 病人的血清VILIP-1 水平，結果顯示，AD 組的血清VIILIP-1高于對照組，AD 癡呆病人血清VILIP-1高于MCI病人。分析原因是：VILIP-1 通過影響人體的Ca2+穩態來促進神經元損傷，它參與調節神經元細胞中Ca2+途徑可能與突觸可塑性有關。通過增強Ca2+對環腺苷酸的作用，VILIP-1會影響環核苷酸級聯反應、煙堿信號傳遞并增加G蛋白的敏感性。此外，VILIP-1可以促進神經元死亡和異常磷酸化。VILIP-1 在被Ca2+激活后可以與肌動蛋白和mRNA 結合，這意味著VILIP-1 在亞細胞水平上參與了mRNA 的調節。同時，通過調節突觸前和突觸后的相關信息，VILIP-1受體的磷酸化與記憶的形成有關。從病理生理學的角度來看，VILIP-1可以作為AD 的新的潛在血液學生物學標志。血清VILIP-1 與MMSE 得分呈負相關。AD 病人的VILIP-1 水平升高，VILIP-1 通過影響神經元細胞的鈣穩態來促進神經元變性和壞死，從而使細胞內VILIP-1釋放到血液中。血液中VIPLP-1 的水平升高，病人的認知功能受損。目前，未見有關于VILIP-1 與AD中τ 蛋白、β-AP 之間具體關聯的研究，考慮三者在一定程度上互相協同，共同參與了AD 的發生發展，關于這方面的研究將是今后的研究方向。VILIP-1可用作診斷AD 和病人認知功能障礙嚴重程度的標志物，監測疾病的發展和藥物治療的效果。而且，血樣具有采集方便，無創，可行性強，安全性好，協調性好等優點，在臨床上具有廣闊的應用前景。

故本研究首次將Tau 蛋白、Aβ 和VILIP-1 與老年AD 病人認知功能障礙的關系進行分析，通過早期相關血清Tau 蛋白、Aβ 和VILIP-1 來對病人認知功能變化情況進行反映，具有明顯的創新性，不僅檢測效果良好，且樣品易于獲取，且為無創性，而且可以重復檢測，能被病人廣泛接受。

綜上所述，AD 病人血清τ 蛋白、β-AP、VILIP-1水平升高，與病人認知功能障礙呈負相關性，可能在病人認知功能判斷中有一定應用價值。