長鏈非編碼RNA DLX6-AS1與微小RNA-346在糖尿病足72例血清中的表達及其臨床意義

李杰玉，林玉玲，李曾一，劉琳，金文波

糖尿病足潰瘍是糖尿病主要并發癥之一，神經與血管病變、感染等可促進糖尿病足潰瘍的發生，其中炎癥反應與細菌感染是造成糖尿病足潰瘍病人截肢甚至死亡的重要原因［1-4］。但糖尿病足潰瘍細菌感染及其與血管病變的相關性尚未完全闡明。長鏈非編碼RNA（lncRNA）DLX6-AS1在糖尿病腎病中呈高表達，而微小RNA（miR）-346 表達下調，DLX6-AS1 可能靶向調控miR-346 表達從而參與糖尿病腎病發生及發展過程［5］。研究表明miR-346 在高糖誘導的足細胞分化中發揮重要調控作用［6］。但DLX6-AS1、miR-346 在糖尿病足潰瘍中的表達水平尚未可知。本研究通過檢測糖尿病足潰瘍病人血清中DLX6-AS1、miR-346 的表達水平，分析其與炎性因子水平的相關性，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017 年5 月至2018 年12 月南陽市中心醫院收治的72 例糖尿病足病人為糖尿病足組，所有病人均符合糖尿病足的診斷標準［7］。糖尿病足組病人年齡（65±6）歲，范圍為50～70歲；病程（13.25±7.65）年；男40 例，女32 例。根據Wagner 分級標準［8］將糖尿病足病人分為1 級14 例、2 級14 例、3 級14 例、4 級16 例、5 級14 例。選取同期該院收治的60 例2 型糖尿病病人為糖尿病組，所有病人均符合2 型糖尿病診斷標準［9］，且未達到糖尿病足的診斷標準，其中男35 例，女25 例；年齡（66±6）歲，范圍為52～71歲；病程（14.13±6.12）年。選取同期于該院進行健康體檢的健康志愿者55例作為對照組，其中男28 例，女27 例；年齡（67±7）歲，范圍為51～76 歲。各組研究對象年齡、性別比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準：糖尿病足病人為第1 次發生足部潰瘍；糖尿病組與對照組受檢者均無足部潰瘍；無心功能障礙者；無肝、腎功能不全者。排除標準：外周血管病變病人；合并其他內分泌系統疾病者；合并惡性腫瘤病人。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，所有病人知情且簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集血液樣本 所有研究對象均于入組次日清晨抽取空腹靜脈血5 mL，4 ℃條件下經3 000 r/min 離心6 min，吸取血清，置于-20 ℃冰箱內保存待測。

1.2.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測細胞中DLX6-AS1、miR-346 的表達水平 取凍存血清樣本，采用Trizol 法提取血清中總RNA。參照逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為互補DNA（cDNA）。以cDNA 為模板進行qRT-PCR 反應，反應條件：95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共循環40 次。DLX6-AS1 以GAPDH 為內參，miR-346 以U6 為內參，采用2-ΔΔCt法計算DLX6-AS1、miR-346 相對表達量。Trizol、逆轉錄與熒光定量PCR試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司。

1.2.3 酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測炎性因子水平 采用ELISA檢測血清炎性因子血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、成纖維細胞生長因子2（FGF2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，Multiskan MK3 酶標儀購自美國Thermo Fisher公司。采用電化學發光法檢測血清中白細胞介素-6（IL-6）水平，Cobas e601電化學發光免疫分析儀及檢測試劑盒購自美國Roche 公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 觀察指標 檢測所有研究對象收縮壓、舒張壓、空腹血糖、糖化血紅蛋白（HbA1c），檢測儀器購自美國Bio-Rad公司。

1.3 統計學方法采用統計學軟件SPSS 21.0 進行分析。符合正態分布的計量資料以± s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料采用χ2檢驗；采用Pearson相關性分析檢驗變量間的相關性；采用logistic 回歸分析研究影響糖尿病足發生的相關因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組研究對象一般資料比較三組受檢者收縮壓、舒張壓、HbA1c比較差異無統計學意義（P＞0.05），糖尿病組、糖尿病足組病人空腹血糖、VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 水平高于對照組（P＜0.05），糖尿病組與糖尿病足組VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 水平比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 健康者55例與糖尿病132例一般資料比較/± s

注：HbA1c為糖化血紅蛋白，VCAM-1為血管細胞黏附分子-1，FGF2為成纖維細胞生長因子2，TNF-α 為腫瘤壞死因子-α，IL-6為白細胞介素-6。①與對照組相比，P＜0.05。②與糖尿病組相比，P＜0.05。

臨床指標收縮壓/mm Hg舒張壓/mm Hg HbA1c/%空腹血糖/（mmol/L）VCAM-1/（μg/L）FGF2/（ng/L）TNF-α/（ng/L）IL-6/（ng/L）對照組（n=55）124.35±10.32 79.51±14.65 5.23±0.36 4.85±0.96 136.58±56.32 8.56±1.36 6.57±1.35 3.25±1.03糖尿病組（n=60）126.57±16.57 80.13±15.24 5.42±1.58 8.21±2.54①653.24±175.45①12.65±3.71①16.15±4.16①4.59±1.13①糖尿病足組（n=72）127.59±18.46 81.11±12.57 5.44±1.23 8.42±2.56①865.42±132.26①②17.68±5.13①②21.74±6.52①②15.68±3.21①②F值0.66 0.21 0.56 48.29 484.29 87.39 160.42 654.14 P值0.516 0.811 0.575＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 各組研究對象血清中lncRNA DLX6-AS1 與miR-346 的表達比較與對照組相比，糖尿病組與糖尿病足組病人血清中DLX6-AS1 的表達水平顯著升高（P＜0.05），miR-346 的表達水平顯著降低（P＜0.05），糖尿病組與糖尿病足組血清中DLX6-AS1、miR-346 的表達水平相比差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 健康者55例與糖尿病132例血清中DLX6-AS1與miR-346的表達比較/± s

表2 健康者55例與糖尿病132例血清中DLX6-AS1與miR-346的表達比較/± s

注：①與對照組相比，P＜0.05。②與糖尿病組相比，P＜0.05。

組別對照組糖尿病組糖尿病足組F值P值例數55 60 72 DLX6-AS1 1.01±0.13 2.16±0.25①3.20±1.03①②172.54＜0.001 miR-346 1.00±0.16 0.73±0.11①0.41±0.08①②397.60＜0.001

2.3 DLX6-AS1 與miR-346 在不同Wagner 分級糖尿病足組病人血清中的表達比較與Wagner分級1級糖尿病足病人相比，2～5級病人血清DLX6-AS1的表達水平顯著升高（P＜0.05），miR-346 的表達水平顯著降低（P＜0.05），見表3。

2.4 糖尿病足組病人血清中DLX6-AS1、miR-346的表達與炎性因子水平的相關性分析Pearson 相關性分析顯示糖尿病足病人血清中DLX6-AS1 的表達 與VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 呈 正 相 關（P＜0.05），miR-346 與FGF2、TNF-α、IL-6 呈負相關（P＜0.05），見表4。

表3 DLX6-AS1與miR-346在不同Wagner分級糖尿病足72例血清中的表達比較/± s

表3 DLX6-AS1與miR-346在不同Wagner分級糖尿病足72例血清中的表達比較/± s

注：①與1級相比，P＜0.05。

Wagner分級1級2級3級4級5級F值P值例數14 14 14 16 14 DLX6-AS1 1.23±0.18 2.11±0.15 2.58±0.16 3.01±0.16 3.31±0.37①198.54＜0.001 miR-346 0.98±0.13 0.65±0.10 0.63±0.11 0.53±0.13 0.35±0.09①57.59＜0.001

表4 糖尿病足72例血清中DLX6-AS1、miR-346的表達與炎性因子水平的Pearson相關性分析結果

2.5 影響糖尿病足發生的多因素分析采用logistic 回歸分析對影響糖尿病足發生的相關因素進行分析，結果顯示血清中DLX6-AS1 表達量升高與miR-346 表達量是影響糖尿病足發生的獨立危險因素（P＜0.05），見表5。

表5 影響糖尿病足發生的多因素logistic回歸分析結果

3 討論

lncRNA 可通過調控下游miRNA 表達從而參與多種炎性反應疾病發生過程，研究表明lncRNA 在糖尿病足病人中異常表達并可能參與該疾病發生及發展過程［10-11］。但lncRNA 在糖尿病足發生過程中的調控機制尚未闡明，因而本研究積極尋找新型lncRNA，初步分析其在糖尿病足病人中的表達，為深入了解糖尿病足的病理生理機制提供新方向。

DLX6-AS1 在大腸癌、膀胱癌、宮頸癌等腫瘤中呈高表達并可促進腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲［12-14］。但DLX6-AS1 在糖尿病足中的表達尚未可知。本研究結果顯示糖尿病足病人血清中DLX6-AS1 的表達水平顯著升高，隨著Wagner 分級的增加DLX6-AS1的表達水平明顯升高，提示DLX6-AS1 表達量升高可能促進糖尿病足發生及發展。研究表明炎性因子VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 在糖尿病足病人中的水平升高，并可促進其發展進程［15-16］。與上述研究結果相似，本研究結果顯示糖尿病足病人血清中炎性因子VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 水平明顯高于糖尿病組病人，提示炎性因子VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 水平升高可加重糖尿病足的嚴重程度。本研究進一步分析顯示DLX6-AS1 表達量與炎性因子VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 呈正相關，說明隨著DLX6-AS1 表達量的升高可明顯促進糖尿病足病人體內炎癥反應的發生。提示DLX6-AS1 可能在糖尿病足發生過程中發揮重要調控作用。

miR-346 在膿毒癥病人中表達下調，并可參與膿毒癥發生及發展過程［17-18］。有研究表明miR-346還可調節機體免疫反應［19］。本研究結果顯示miR-346 在糖尿病足病人血清中的表達下調，隨著Wagner 分級的增加miR-346 的表達量明顯降低，其低表達量與炎性因子FGF2、TNF-α、IL-6 呈負相關，提示miR-346 表達量降低可能促進糖尿病足的發生及發展。同時本研究采用logistic 回歸分析對影響糖尿病足發生的相關因素進行分析，結果顯示血清中DLX6-AS1 與miR-346 表達量是影響糖尿病足發生的獨立危險因素，提示血清中DLX6-AS1 表達水平升高與miR-346表達水平降低可增加糖尿病足的發生風險。

綜上所述，糖尿病足病人血清中DLX6-AS1 表達升高，miR-346 表達降低，二者表達量變化與糖尿病足進展密切相關，還與糖尿病足炎癥反應程度有關，可能作為臨床診斷糖尿病足的有效標志物，還可為揭示糖尿病足發病機制提供新思路。但本研究樣本量較小，后續還須擴大樣本量進一步證實。