微小RNA-29a和內(nèi)皮聯(lián)蛋白在子癇前期107例胎盤組織中的表達(dá)及臨床意義

馮冰霜

子癇前期是妊娠特有的多系統(tǒng)受累的疾病，是妊娠20周后出現(xiàn)的以高血壓、蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)的一組臨床癥候群［1］。在全球范圍內(nèi)，每年因子癇前期死亡的大約有50 多萬新生兒和胎兒以及7萬多孕產(chǎn)婦，發(fā)病率約為2%～8%［2］。而重度子癇前期可引起肝酶升高、溶血、血小板減少等，導(dǎo)致全身多個(gè)系統(tǒng)器官損害［3］。微小RNA（miRNA，miR）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種單鏈非編碼小RNA，在基因表達(dá)過程中充當(dāng)著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，可通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)的特異性序列結(jié)合，抑制靶mRNA 翻譯或使其降解，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能。有研究表明，在子癇前期孕婦胎盤組織中miR-29a 表達(dá)水平較高［4］。內(nèi)皮聯(lián)蛋白是一種存在于細(xì)胞表面的由二硫鍵相連的同型二聚體膜結(jié)合的糖蛋白，是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）受體家族的共同受體，是影響血管生成的重要因素［5］。本研究對(duì)子癇前期胎盤組織中的miR-29a 和內(nèi)皮聯(lián)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，探討兩者在不同程度子癇前期孕婦胎盤組織中的表達(dá)水平和臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料抽簽選取2017 年7 月至2019 年7月宜昌市婦幼保健院收治的行剖宮產(chǎn)的子癇前期病人107 例，根據(jù)病情程度［6］分為輕度子癇前期組48 例，年齡（29.05±2.52）歲；重度子癇前期組59 例，年齡（28.91±1.44）歲。另選取同期行剖宮產(chǎn)分娩的健康孕婦56 例作為對(duì)照組，年齡（28.66±3.05）歲。三組孕婦年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

子癇前期納入標(biāo)準(zhǔn)：被確診為子癇前期者［6］；病人或其近親屬知情同意；選擇接受剖宮術(shù)分娩；均為單胎初次妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：輔助生殖技術(shù)受孕者；孕前患有高血壓者；嚴(yán)重肝腎疾病、自身免疫病者；妊娠期糖尿病、胎盤早剝等其他產(chǎn)科并發(fā)癥。

1.2 主要試劑與儀器磷酸緩沖鹽溶液（貨號(hào)R22127），上海恒斐生物科技公司；Trizol 試劑（型號(hào)CD-102523GM），武漢純度生物科技公司；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)AOPR），上海伯易生物科技公司；紫外分光儀（型號(hào)SPCC），東莞市標(biāo)普實(shí)驗(yàn)器材科技公司；SP 試劑盒（貨號(hào)1533661828），上海江萊生物科技公司；抗人內(nèi)皮聯(lián)蛋白單克隆抗體（貨號(hào)HM2140），廈門慧嘉生物科技公司；聚甲醛（貨號(hào)YKS-10010），廈門研科生物技術(shù)公司；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)CKX53OLYMPUS），上海土森視覺科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 采集標(biāo)本 胎盤娩出后10 min 內(nèi)取胎盤母體面中央?yún)^(qū)絨毛組織大小約1 cm×1 cm×1 cm 無鈣化、無機(jī)化的組織，磷酸緩沖鹽溶液漂洗，4%聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)胎盤中內(nèi)皮聯(lián)蛋白水平免疫組織化學(xué)SP 法測(cè)定三組孕婦胎盤組織中內(nèi)皮聯(lián)蛋白表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。光學(xué)顯微鏡下觀察，內(nèi)皮聯(lián)蛋白免疫組織化學(xué)染色陽性為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色顆粒，應(yīng)用每張切片隨機(jī)選取不重疊的10 個(gè)高倍鏡視野（×400），用Image-Pro Plus6.0（IPP）彩色圖像分析系統(tǒng)分別計(jì)算每個(gè)高倍鏡視野下內(nèi)皮聯(lián)蛋白的平均光密度值（MOD）。取平均值作為每張切片內(nèi)皮聯(lián)蛋白陽性表達(dá)的MOD值。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)胎盤中miR-29a 表達(dá)水平 用Trizol 試劑從胎盤組織中提取總RNA，之后用紫外分光儀檢測(cè)RNA 的純度和濃度，選取吸光度在1.8～2.1 的樣品，采用miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)miR-29a 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得互補(bǔ)DNA（cDNA）。取miR-29a 的cDNA 1 μL，加入通用后端引物1 μL，miR-29a 特異前端引物1 μL，2×SYBR GREEN Master Mix 1 μL，再加入無菌蒸餾水至20 mL。反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算各組miR-29a表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0 分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以± s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)（%）表示；用Pearson 相關(guān)性分析檢驗(yàn)子癇前期胎盤miR-29a 和內(nèi)皮聯(lián)蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組孕婦臨床特征的比較三組孕婦分娩孕周比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓、24 h 尿蛋白比輕度子癇前期組和重度子癇前期組低，輕度子癇前期組比重度子癇前期組低（P＜0.05）。見表1。

2.2 三組孕婦胎盤組織中miR-29a 和內(nèi)皮聯(lián)蛋白的表達(dá)水平比較對(duì)照組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組胎盤組織miR-29a 和內(nèi)皮聯(lián)蛋白表達(dá)水平依次升高，每兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1，2；表2。

2.3 子癇前期孕婦胎盤組織中miR-29a 和內(nèi)皮聯(lián)蛋白表達(dá)水平相關(guān)性分析子癇前期孕婦胎盤組織中miR-29a 和內(nèi)皮聯(lián)蛋白水平呈正相關(guān)（r=0.52，P＜0.001）。

2.4 三組孕婦并發(fā)癥比較重度子癇前期組胎兒窘迫、產(chǎn)后大出血等并發(fā)癥均高于輕度子癇前期組和對(duì)照組（P＜0.05），見表3。

注：1—U6；2—miR-29a；3—對(duì)照組；4—輕度子癇前期組；5—重度子癇前期組。

表2 三組孕婦胎盤組織中miR-29a和內(nèi)皮聯(lián)蛋白的表達(dá)水平比較/± s

表2 三組孕婦胎盤組織中miR-29a和內(nèi)皮聯(lián)蛋白的表達(dá)水平比較/± s

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與輕度子癇前期組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組輕度子癇前期組重度子癇前期組F值P值例數(shù)56 48 59 miR-29a 1.09±0.21 3.18±1.19①6.04±1.91①②202.68＜0.001內(nèi)皮聯(lián)蛋白0.22±0.10 0.37±0.14①0.49±0.22①②39.25＜0.001

2.5 二元logistic 回歸分析孕婦發(fā)生子癇前期的影響因素以孕婦是否發(fā)生子癇前期為因變量，以收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓、24 h尿蛋白、miR-29a、內(nèi)皮聯(lián)蛋白水平為自變量，進(jìn)行二元logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，miR-29a、內(nèi)皮聯(lián)蛋白水平偏高是孕婦發(fā)生子癇前期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表4。

3 討論

子癇前期是一種繼發(fā)于血管痙攣從而導(dǎo)致的內(nèi)皮激活、器官灌注量減少的一種特殊妊娠綜合征［7］，主要臨床表現(xiàn)為妊娠20 周后，出現(xiàn)高血壓、蛋白尿及全身器官功能損害［5］。常引起胎兒宮內(nèi)缺氧和生長受限，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的重要原因［8-9］。有研究表明，絨毛間隙含氧量低導(dǎo)致氧化應(yīng)激和滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡、壞死，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和全身系統(tǒng)性炎癥［10］，促炎細(xì)胞因子通過抑制間質(zhì)金屬蛋白酶2 活性，從而抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力［11］，使得胎盤灌注減少和缺氧，進(jìn)一步致使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，最終發(fā)生子癇前期［12-14］。也有研究表明，免疫T 細(xì)胞減少，母胎免疫耐受降低，進(jìn)而引發(fā)子癇前期［15］。子癇前期發(fā)生率為2%～8%，因其危害性極大，因此成為臨床研究的重點(diǎn)。

表4 二元logistic回歸分析孕婦163例發(fā)生子癇前期的影響因素

miRNA 是一種非編碼小分子RNA，對(duì)基因表達(dá)有重要調(diào)控作用［16］。研究發(fā)現(xiàn)miR-29a 可靶向調(diào)控胃癌細(xì)胞遷移侵襲，靶向調(diào)控肺癌細(xì)胞侵襲等［17-18］。莫玉俏等［4］在研究miR-29a 對(duì)人正常滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲功能的影響中發(fā)現(xiàn)，在子癇前期孕婦胎盤組織中miR-29a表達(dá)水平比正常孕婦高，miR-29a可能通過負(fù)調(diào)控β1 整合素表達(dá)參與子癇前期的病程進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組胎盤組織中miR-29a 表達(dá)水平依次升高，和前人研究結(jié)果一致，提示miR-29a 可能參與了子癇前期的發(fā)生和發(fā)展過程，并與子癇前期的嚴(yán)重程度有關(guān)。

子癇前期與滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤功能有關(guān)，而內(nèi)皮聯(lián)蛋白是滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤功能相關(guān)因素之一。有研究表明胎盤組織內(nèi)皮聯(lián)蛋白高表達(dá)可能和代償機(jī)制有關(guān)，即子癇前期胎盤滋養(yǎng)層浸潤過淺，導(dǎo)致胎盤形成不良、缺血，內(nèi)皮聯(lián)蛋白過表達(dá)促進(jìn)TGF-β 分泌，并阻礙滋養(yǎng)細(xì)胞入侵和遷移［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組胎盤組織內(nèi)皮聯(lián)蛋白表達(dá)水平依次升高，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示內(nèi)皮聯(lián)蛋白可能與子癇前期的嚴(yán)重程度有關(guān)，推測(cè)在胎盤組織中內(nèi)皮聯(lián)蛋白表達(dá)的升高會(huì)使可溶性內(nèi)皮聯(lián)蛋白升高，進(jìn)一步引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，抑制血管生成，內(nèi)皮聯(lián)蛋白的表達(dá)隨著子癇前期病癥的發(fā)展程度而逐漸增高，內(nèi)皮聯(lián)蛋白表達(dá)參與子癇前期疾病進(jìn)展。

表1 三組孕婦臨床特征比較/± s

表1 三組孕婦臨床特征比較/± s

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與輕度子癇前期組比較，P＜0.05。

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表3 三組孕婦并發(fā)癥比較/例（%）

分析子癇前期胎盤組織miR-29a 和內(nèi)皮聯(lián)蛋白表達(dá)水平相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-29a 和內(nèi)皮聯(lián)蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。可能是因?yàn)樽影B前期胎盤組織中異常表達(dá)的miR-29a，影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲［4］，滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力的降低使胎盤組織內(nèi)皮聯(lián)蛋白表達(dá)升高，導(dǎo)致胎盤灌注減少和缺氧，進(jìn)一步致使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，最終出現(xiàn)子癇前期。對(duì)比三組孕婦并發(fā)癥發(fā)生情況可知，重度子癇前期組胎兒窘迫、產(chǎn)后大出血、胎盤早剝、胎膜早破、羊水過少、前置胎盤發(fā)生率均高于輕度子癇前期組和對(duì)照組，說明隨著子癇前期病情加重，并發(fā)癥概率越高。進(jìn)一步經(jīng)二元logistic 回歸分析顯示，miR-29a、內(nèi)皮聯(lián)蛋白水平偏高是孕婦發(fā)生子癇前期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示miR-29a、內(nèi)皮聯(lián)蛋白水平與子癇前期密切相關(guān)，可能影響疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。

綜上所述，子癇前期孕婦胎盤組織中miR-29a和內(nèi)皮聯(lián)蛋白表達(dá)水平隨著病情的加重而不斷升高，miR-29a 和內(nèi)皮聯(lián)蛋白水平呈正相關(guān)，是孕婦發(fā)生子癇前期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為子癇前期病情的參考指標(biāo)。有關(guān)子癇前期胎盤組織中miR-29a 和內(nèi)皮聯(lián)蛋白相關(guān)的調(diào)控機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

（本文圖2見封三）