曲美他嗪對重癥肺炎大鼠的肺保護作用及其機制研究*

范曉航，劉麗琴，胡伊瑤，趙雪紅，李泉，王穎

[1.湖北文理學院 醫學部，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學院附屬醫院（襄陽市中心醫院）腫瘤科，湖北 襄陽 441021；3.海南省人民醫院（海南醫學院附屬海南醫院）麻醉科，海南 海口570311]

重癥肺炎是常見的進展性呼吸系統危重疾病，除低氧血癥及進行性呼吸困難等表現外，還可發展至全身性感染，甚至危及生命[1]。曲美他嗪（Trimetazidine,TMZ）是一種代謝調節劑，常作為抗心肌缺血、改善心肌代謝藥物使用，可用于慢性肺源性心臟病的治療[2]。有研究顯示，TMZ 聯合中藥方劑治療心力衰竭合并肺部感染的有效率達96.67%，推測其具有肺保護作用[3]。然而，目前關于TMZ 治療重癥肺炎的療效及機制研究尚少。本研究通過復制重癥肺炎大鼠模型，觀察TMZ 的肺保護作用，并探討其可能機制，為臨床用藥提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

45 只SD 雄性大鼠，6 周齡，體重（200±20）g，購自上海昇敞生物科技有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2021-0002]，飼養于湖北奧菲生物科技有限公司[實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2019-0109]。

1.2 菌株

肺炎克雷伯菌標準株購自蘇州達麥迪生物醫學科技有限公司。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 主要試劑鹽酸TMZ 片（南京恒生制藥有限公司，國藥準字H20073969），哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）激活劑磷脂酸（phosphatidic acid,PA）（上海甄準生物科技有限公司），CD4＋抗體、白細胞介素17（Interleukin-17,IL-17）抗體（上海研晶生物科技有限公司），白細胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（上海酶研生物科技有限公司），兔抗大鼠蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）、p-Akt、mTOR、p-mTOR 一抗（美國R&D 公司）。

1.3.2 儀器CytoFLEX 流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司），SAR-830 小動物呼吸機（美國CWE 公司），DM500 光學顯微鏡（德國徠卡微系統有限公司），DYCZ-24 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 重癥肺炎模型的復制及分組模型復制前1 天制備細菌混懸液。將肺炎克雷伯菌株ATCC700603 接種至瓊脂糖平板，標準條件下培養24 h 后收集細菌，采用比濁法經無菌生理鹽水稀釋至含有400 個麥氏濁度單位的混懸液（1 個麥氏濁度單位為3×1011CFU/L）。45 只SD 大鼠中隨機抽取35 只，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，頸部消毒備皮，暴露并切開大鼠上段氣管。采用24 G Y 型靜脈留置針氣管插管，拔除針芯后保持導管完全置入氣管，經導管注入細菌混懸液0.35 mL（含有400 個麥氏濁度單位肺炎克雷伯菌），立起固定臺后緩慢注射，期間左右旋轉固定臺2 次，注射完成后縫合切口，常規消毒。模型復制成功標準：術后72 h 大鼠反應遲鈍、呆滯；呼吸急促，雙側胸廓明顯運動；X 射線可觀察到兩肺有彌漫性滲出陰影；動脈血氧分壓≤60 mmHg 或動脈血氧飽和度＜90%[4]。35 只大鼠死亡5 只，模型復制成功30 只，隨機分為重癥肺炎（SP）組、TMZ 組、TMZ 聯合PA 組，每組10 只。余10 只注射無菌生理鹽水0.35 mL，設為對照組。

1.4.2 干預方式模型復制成功后，TMZ 組灌胃TMZ 生理鹽水溶液5 mL，劑量20 mg/kg，尾靜脈注射生理鹽水1 mL；TMZ 聯合PA 組灌胃TMZ 生理鹽水溶液5 mL，劑量20 mg/kg，尾靜脈注射PA 生理鹽水溶液1 mL，劑量1 mg/kg；對照組、SP 組分別灌胃、尾靜脈注射等體積生理鹽水[5]。各組1 次/d，連續干預6 d。

1.4.3 外周血輔助性T 細胞17（T helper cell 17,Th17）和調節性T 細胞（regulatory T cell,Treg）檢測末次給藥后，禁食不禁水24 h。戊巴比妥鈉麻醉后抽取大鼠腹主動脈血5 mL，轉移至加有肝素的抗凝管中，等比例混合PBS 緩沖液，梯度離心，分離淋巴細胞，洗滌后調整細胞密度至1×107個/mL。取96 孔板，每孔加入淋巴細胞懸液100 μL 和刺激劑0.5 μL，每組設置同型對照，培養箱孵育1 h 后采用阻斷劑阻斷，繼續孵育12 h，轉移細胞懸液至流式管中，加入CD4 抗體0.5 μL，常溫遮光孵育20 min，PBS 洗滌后離心棄上清液，PBS 100 μL 重懸，加入固定破膜工作液，振蕩5 s，4℃遮光孵育35 min，加入破膜緩沖工作液2 mL，離心棄上清液，加入PBS 緩沖液至100 μL，重懸。在測定管中加入IL-17 抗體0.7 μL（檢測Th17 細胞）或Foxp3 抗體5 μL（檢測Treg 細胞），將等量、同型對照抗體加入對照管中，4℃遮光孵育40 min，洗滌后棄上清液，加入4%多聚甲醛重懸，4℃遮光保存，24 h 內使用流式細胞儀檢測Th17、Treg[6]。

1.4.4 肺功能指標檢測抽取大鼠腹主動脈血5 mL后取大鼠頸部正中切口，在第3 與第4 氣管環中進行倒T 型切口插管，采用手術線系緊氣管插管，將大鼠置入體描箱，與呼吸機連接，通過AniRes 2005軟件記錄其肺容積變換量、靜息通氣量[7]。

1.4.5 ELISA 檢測肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）IL-1β、TNF-α水平肺功能指標檢測完成后頸椎脫臼處死大鼠，迅速逐層分離頸部皮膚，暴露氣管取肺，手術線結扎、固定右肺；左肺經37℃生理鹽水2 mL 灌洗3 次，回收后（回收率＞80%）離心收集BALF 上清液。采用ELISA 檢測BALF 中IL-1β、TNF-α 水平，實驗流程嚴格按照試劑盒說明書設計，采用酶標儀測定570 nm 波長處的吸光度值，根據標準曲線計算IL-1β、TNF-α 水平[8]。

1.4.6 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色觀察肺組織病理學變化取結扎未經灌洗的右肺，分成2 份，一份用4%多聚甲醛固定，另一份在-80℃條件下保存。取4%多聚甲醛固定48 h 的肺組織，流水沖洗30 min，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，病理切片機切成4 μm 厚切片，HE 染色后用顯微鏡觀察肺組織病理學變化[9]。

1.4.7 Western blotting 檢測肺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 蛋白的表達取-80℃保存的肺組織，RIPA 細胞裂解液裂解，冰上離心取上清液，BCA 法測定蛋白含量。取50 μg 待測蛋白，按1∶5 與樣品緩沖液混合，金屬浴煮沸5 min，離心取上清液，上樣電泳，濕轉至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫搖床封 閉2 h，TBST 清洗，加入兔抗大鼠Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 一抗（1∶500），4℃搖床孵育2 h，TBST 清洗，加入山羊抗兔IgG 二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST 清洗，ECL 發光液顯色，置于暗室曝光，采用一體式凝膠成像系統分析，以Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 蛋白與內參GAPDH 灰度值的比值表示蛋白相對表達量[10]。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 24.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠外周血Th17、Treg、Th17/Treg比較

對照組、SP 組、TMZ 組、TMZ 聯合PA 組外周血Th17、Treg、Th17/Treg 比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=57.766、16.254 和239.835，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，SP組外周血Th17 和Th17/Treg 升高（P＜0.05），Treg 降低（P＜0.05）；與SP 組比較，TMZ 組外周血Th17 和Th17/Treg 降低（P＜0.05），Treg 升高（P＜0.05）；與TMZ 組比較，TMZ 聯合PA 組外周血Th17 和Th17/Treg 降低（P＜0.05），Treg 升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠外周血Th17、Treg、Th17/Treg比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠外周血Th17、Treg、Th17/Treg比較（n=10，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與SP 組比較，P＜0.05；③與TMZ組比較，P＜0.05。

Th17/Treg 0.29±0.03 1.16±0.12①0.69±0.08②0.44±0.05③239.835 0.000組別對照組SP組TMZ組TMZ+PA組F 值P 值Th17/%1.45±0.20 3.39±0.48①2.46±0.37②1.89±0.28③57.766 0.000 Treg/%4.92±0.74 2.91±0.64①3.55±0.71②4.25±0.63③16.254 0.000

2.2 各組大鼠肺功能比較

對照組、SP 組、TMZ 組、TMZ 聯合PA 組肺容積變換量、靜息通氣量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=85.960 和47.149，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，SP 組肺容積變換量、靜息通氣量減少（P＜0.05）；與SP 組比較，TMZ 組肺容積變換量、靜息通氣量增加（P＜0.05）；與TMZ 組比較，TMZ 聯合PA 組肺容積變換量、靜息通氣量減少（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺功能指標比較 （n=10，±s）

表2 各組大鼠肺功能指標比較 （n=10，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與SP 組比較，P＜0.05；③與TMZ組比較，P＜0.05。

組別對照組SP組TMZ組TMZ+PA組F 值P 值肺容積變換量/mL 0.29±0.03 0.09±0.02①0.21±0.04②0.16±0.02③85.960 0.000靜息通氣量/（mL/min）3.30±0.47 1.46±0.28①2.70±0.36②2.13±0.31③47.149 0.000

2.3 各組大鼠BALF中IL-1β、TNF-α水平比較

對照組、SP 組、TMZ 組、TMZ 聯合PA 組BALF中IL-1β、TNF-α 水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=186.449 和230.659，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，SP 組BALF中IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與SP 組比較，TMZ 組BALF 中IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.05）；與TMZ 組比較，TMZ 聯合PA 組BALF 中IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠BALF中IL-1β、TNF-α水平比較（n=10，pg/mL，±s）

表3 各組大鼠BALF中IL-1β、TNF-α水平比較（n=10，pg/mL，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與SP 組比較，P＜0.05；③與TMZ組比較，P＜0.05。

TNF-α 42.69±6.72 498.51±68.24①160.27±25.70②297.83±35.91③230.659 0.000組別對照組SP組TMZ組TMZ+PA組F 值P 值IL-1β 75.24±12.69 563.97±79.32①195.23±28.02②301.81±45.50③186.449 0.000

2.4 肺組織病理學變化

HE 染色結果顯示，對照組肺泡結構及支氣管壁清晰、完整，未觀察到明顯的炎癥浸潤；SP 組肺泡結構被破壞，肺泡間隔擴大，支氣管壁厚度明顯增加，可觀察到大量炎癥細胞浸潤；TMZ 組、TMZ 聯合PA 組較SP 組肺泡間隔縮小，支氣管壁厚度變小，炎癥細胞浸潤減少，其中TMZ 組病理變化改善程度優于TMZ 聯合PA 組。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理學變化 （HE染色×200）

2.5 各組大鼠肺組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比較

對照組、SP 組、TMZ 組、TMZ 聯合PA 組肺組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=128.429 和246.000，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，SP組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 升高（P＜0.05）；與SP組比較，TMZ 組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 降低（P＜0.05）；與TMZ 組比較，TMZ 聯合PA 組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高（P＜0.05）。見表4和圖2。

圖2 各組大鼠肺組織p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白的表達

表4 各組大鼠肺組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比較（n=10，±s）

表4 各組大鼠肺組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比較（n=10，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與SP 組比較，P＜0.05；③與TMZ組比較，P＜0.05。

p-mTOR/mTOR 0.11±0.02 0.75±0.08①0.32±0.04②0.50±0.06③246.000 0.000組別對照組SP組TMZ組TMZ+PA組F 值P 值p-Akt/Akt 0.32±0.04 0.92±0.07①0.71±0.08②0.80±0.09③128.429 0.000

3 討論

目前肺炎仍是感染性疾病死亡的重要病因之一。統計資料顯示，重癥肺炎占肺炎的10%～20%，且病死率高達30%～50%[11]。有報道顯示，重癥肺炎不僅是病原菌與毒素直接損傷所致，而且與機體被病原體感染后炎癥反應失控關系密切[12]。重癥肺炎發生時淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞釋放大量炎性介質聚集于肺，形成“瀑布樣”炎癥級聯反應，導致免疫功能紊亂。因此，抑制重癥肺炎炎癥反應、改善免疫失衡是治療該病的重要思路。

本研究采用TMZ 干預重癥肺炎大鼠后發現，其外周血Th17、Th17/Treg 降低，Treg 升高，肺容積變換量、靜息通氣量增加，且BALF 中IL-1β、TNF-α水平降低，提示TMZ 可改善肺功能及Th17/Treg 平衡，減輕肺部炎癥反應。Th17 細胞是一種經核轉錄因子維甲酸相關孤兒受體γt 調控的CD4+T 細胞，主要通過釋放炎癥因子IL-17 促進炎癥反應，在重癥肺炎中異常高表達[13]。Treg 細胞可抑制抗原呈遞細胞及T 細胞功能，減少炎癥細胞因子及抗體產生，減輕炎癥對機體的損傷。TMZ 可促進葡萄糖發生有氧氧化，同時抑制脂肪酸β 氧化，減少ATP 生成過程中耗氧量；清除氧自由基、提高細胞膜穩定性；降低炎癥因子水平，維持自身免疫耐受及免疫內環境平衡。COSGUN 等[14]研究發現，TMZ 離體給藥供體肺，可降低支氣管肺泡灌洗樣本中的硫代巴比妥酸水平及髓過氧化物酶活性，顯著改善移植后肺功能，提示TMZ 具有肺保護功能，與本研究結論相似。

本研究結果顯示，與SP 組比較，TMZ 組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 降低，且TMZ 與PA 聯用可減少TMZ 對重癥肺炎大鼠的肺功能保護作用，推測TMZ 對大鼠的治療作用可能通過抑制PI3K/Akt 信號通路來實現。有研究發現，PI3K/Akt 信號通路的激活或抑制與多種病原體在宿主機體中增殖、致病過程密切相關。Akt、mTOR 是PI3K 下游關鍵效應分子[15]。PI3K 活化生成mPIP3，可誘導Akt、mTOR 磷酸化，進而抑制或激活一系列下游底物調節細胞分化、增殖、遷移等行為。mTOR 是介導淋巴細胞激活PI3K/Akt 信號通路的重要蛋白激酶，在調控細胞增殖、分化及Th17/Treg 平衡中起到重要作用。ROSTAMZADEH 等[16]認為mTOR 是負 向 調節Treg 細胞分化、擴增的關鍵因子，抑制mTOR 活性可阻斷CD4＋T 細胞向Th17 細胞的分化進程，同時促進Treg細胞分化。PA 是mTOR 的強效激活劑，可通過與mTOR 的結構域FRB 競爭性結合激活mTOR1，從而增強PI3K/Akt 信號通路活性。

TMZ 治療重癥肺炎的機制研究彌補了以往研究的不足，具有一定創新性，為臨床重癥肺炎的治療提供了理論依據，并為該病的靶向治療藥物研究奠定基礎。