胃癌組織中Versican與WTAP的表達及其對術后復發或轉移的影響研究*

孫虎，孫穎，王靜松

（1.淮安市第一人民醫院分院 普外科，江蘇 淮安 223002；2.淮安市第一人民醫院普外科，江蘇 淮安 223300）

胃癌居癌癥發病率第2 位，我國是胃癌高發國家，約占全世界發病、病死人數的1/2[1-2]。目前手術仍是根治早期胃癌的主要手段，雖然可將大部分病灶切除，但預后仍不理想，其中術后復發或轉移仍是造成患者死亡的主要原因[3]。癌細胞復發轉移是較為復雜的生理、病理過程，涉及癌細胞從原發瘤體脫落向周圍組織浸潤、入侵血管、增殖分化等。目前國內外研究證實多功能蛋白聚糖Versican 參與胃癌[4]、胰腺癌[5]、子宮內膜癌[6]等多種癌癥的發生、發展，與癌細胞的遷移、浸潤關系密切。成腎細胞瘤1-結合蛋白（Wilms' tumor 1-associating protein,WTAP）是N6- 甲 基 腺 苷（N6-Methyladenosine,m6A）甲基轉移酶復合物的組成部分，可將m6A 甲基轉移酶METTI3 和METTL14 募集到相應的mRNA 靶標以共同催化m6A 的形成，m6A通路失調會影響致癌基因表達，導致腫瘤發生[7]。近期研究顯示WTAP 高表達的胃癌患者預后不良風險高[8]。本研究擬驗證胃癌組織中Versican 與WTAP蛋白表達與臨床病理特征及術后復發或轉移的關系，為胃癌治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年4月—2018年11月淮安市第一人民醫院分院收治的胃癌患者101 例。其中，男性56 例，女性45 例；年齡23～75 歲，平均（50.04±9.17）歲。納入標準：①符合《食管癌和胃癌治療指南》[9]的胃癌診斷標準；②首次行胃癌根治術；③既往未接受任何形式的治療；④年齡＞18 歲。排除標準：①伴有其他部位惡性腫瘤、嚴重內科合并癥者；②重要臟器嚴重功能障礙及存在活動性出血、潰瘍、腸穿孔、腸梗阻者；③伴有免疫缺陷性疾病、傳染性疾病、血液系統疾病、全身系統性疾病者；④伴有精神性疾病、醫患溝通障礙者；⑤肝、肺、腹腔等遠處轉移者；⑥有藥物濫用史、吸毒史者；⑥血栓高度風險者；⑦伴有胃及腹部手術史者；⑧存在手術禁忌證者。剔除標準：①依從性差者；②自然失訪者。本研究經醫院醫學倫理委員會審批準，家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 手術及取材依據患者腫瘤部位選擇性行根治性遠端胃大部切除術、根治性全胃切除術、根治性近端胃大部切除術，具體方法參照《腹腔鏡胃惡性腫瘤手術操作指南（2016 版）》[10]。手術切取病灶，將距腫瘤＞2 cm 的組織作為癌旁組織，確保每位患者所切除組織包含有癌組織和癌旁組織。術后根據患者個體化情況行輔助放化療等治療。

1.2.2 癌組織、癌旁組織中Versican與WTAP蛋白的檢測采取免疫組織化學法檢測癌組織和癌旁組織中COX-2 的表達，標本石蠟包埋、切片，滅活、微波抗原修復、洗滌，添加Versican、WTAP 抗體，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗，滴二氨基聯苯顯色液，蘇木精復染、脫水、封片。染色程度為無色、淡棕色、棕色、棕褐色，分別計0 分、1 分、2 分、3 分；染色范圍＜5%、5%～＜25%、25%～＜75%、≥75%，分別計0 分、1 分、2 分、3 分。計算染色程度與染色范圍評分的乘積，將結果為0 分者作為陰性表達，否則作為陽性表達。

1.2.3 隨訪患者術后以門診復查、住院治療、電話等方式隨訪3年，每1 個月隨訪1 次。統計隨訪期間復發轉移（隨訪中CT、胃鏡等影像學證據顯示腫瘤新發結節和/或腫大淋巴結出現，發現腹腔等遠處轉移癌灶記為復發轉移[11]）情況，出現復發或轉移則終止隨訪。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗；影響因素的分析采用多因素Cox 回歸分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌患者癌組織與癌旁組織中Versican、WTAP蛋白陽性表達率比較

胃癌患者癌組織、癌旁組織中Versican 與WTAP 陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），癌組織高于癌旁組織。見表1。

表1 胃癌患者癌組織、癌旁組織中Versican與WTAP蛋白陽性表達情況 [n=101，例（%）]

2.2 不同臨床特征胃癌患者癌組織中Versican、WTAP蛋白陽性表達率比較

不同性別、年齡、病理類型、腫瘤直徑的胃癌患者癌組織Versican、WTAP 陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。不同病理分化、浸潤深度、腫瘤分期及淋巴結轉移的胃癌患者癌組織Versican、WTAP 陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），低分化、腫瘤分期Ⅲ期、突破漿膜、淋巴結轉移的胃癌患者癌組織Versican、WTAP 陽性表達率分別高于中、高分化，I或Ⅱ期，未突破漿膜，無淋巴結轉移患者（P＜0.05）。見表2。

表2 不同臨床特征胃癌患者癌組織中Versican、WTAP蛋白陽性表達率比較 例（%）

2.3 影響胃癌患者術后復發轉移的單因素分析和多因素Cox回歸分析

患者隨訪結束后，10 例因失訪剔除（7 例為Versican 蛋白陽性表達者，3 例為Versican 蛋白陰性表達者；8 例為WTAP 蛋白陽性表達者，2 例為WTAP蛋白陰性表達者）。91 例胃癌患者中28 例（30.77%）術后出現復發轉移。單因素分析結果顯示，病理分級、腫瘤分期、浸潤深度、淋巴結轉移、Versican 陽性、WTAP 陽性是影響胃癌患者術后復發轉移的影響因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響胃癌患者術后復發轉移的單因素分析參數

以胃癌患者術后復發轉移情況作為因變量（未復發轉移=0，復發轉移=1），病理分級、腫瘤分期、浸潤深度、淋巴結轉移、Versican陽性、WTAP陽性作為自變量（引入水準、剔除水準分別為0.05、0.10），進行多因素Cox 回歸分析。結果顯示：病理分級、腫瘤分期、淋巴結轉移、Versican陽性和WTAP陽性是影響胃癌患者術后復發轉移的獨立因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響胃癌患者術后復發轉移的Cox多因素分析參數

2.4 胃癌患者癌組織中Versican、WTAP表達與術后復發轉移的關系

55例Versican陽性表達患者中無病生存33例，36例陰性表達患者中無病生存30 例。Versican 陽性表達患者與陰性表達患者的無病生存率比較，差異有統計學意義（χ2=5.107，P=0.024）。見圖1。

圖1 Versican陽性表達、陰性表達患者的Kaplan-Meier生存曲線

49 例WTAP 陽性表達患者無病生存29 例，42 例陰性表達患者中無病生存34 例。WTAP 陽性表達患者與陰性表達患者的無病生存率比較，差異有統計學意義（χ2=4.980，P=0.026）。見圖2。

圖2 WTAP陽性表達、陰性表達患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

Versican 屬于大聚集硫酸軟骨素蛋白聚糖，是細胞外基質重要成分，與腫瘤的發生關系密切。Versican 參與腫瘤細胞的生長、遷移、侵襲、血管生成和轉移等病理過程，國內外已有報道指出Versican 在胃癌[12]、肝癌[13]等多種癌癥中異常高表達。但是目前關于Versican 在胃癌中的臨床意義和預后價值仍缺乏數據支持。m6A 甲基化是一種眾所周知的具有新表觀遺傳功能的修飾蛋白，目前國外已有報道指出m6A 參與胃癌的發生、發展[8]，WTAP 作為m6A 甲基化的關鍵組成部分在胃癌發展中的作用尚缺乏報道。基于前人研究，筆者推測Versican、WTAP 不僅參與胃癌的發生，且與胃癌根治術后復發轉移有關，但目前國內尚缺乏胃癌患者癌組織中Versican、WTAP 蛋白表達與術后復發轉移的關系驗證的前瞻性研究報道。本研究采用免疫組織化學法檢測胃癌患者癌組織、癌旁組織中Versican、WTAP 表達情況，并分析、驗證胃癌癌組織中Versican、WTAP 表達與患者臨床病理特征、無病生存的關系，以便為臨床根治胃癌尋找新的靶點。

本研究多因素Cox 回歸分析結果顯示，病理分級、腫瘤分期、淋巴結轉移、Versican 陽性、WTAP 陽性是影響胃癌患者術后復發轉移的獨立因素，提示并印證了癌組織Versican、WTAP 表達是影響胃癌患者術后復發轉移的因素。細胞外基質可調節細胞遷移、分化、增殖，細胞外基質受體相互作用已被證明與胃癌等多種癌細胞增殖、侵襲有關[14]，細胞外基質富含Versican，其參與細胞外基質受體相互作用及趨化因子信號、Toll 樣受體信號、T 細胞受體信號、Wnt 信號傳遞，細胞增殖、分化、黏附及細胞外基質的穩態及完整性變化可導致Versican 的異常表達，反過來又可調節細胞外基質組織，促進腫瘤生長，在細胞外基質中與CD44、透明質酸反應形成大分子復合物，促進腫瘤細胞運動，增加腫瘤血管生成、轉移風險。m6A RNA 修飾是涉及mRNA 成熟、蛋白質翻譯和分子結構轉化等多個細胞過程的重要組成部分，越來越多的證據表明m6A 失調對胃癌等多種疾病的發病機制具有重要的影響。WTAP 是m6A 甲基化的關鍵組成部分，YU 等[15]研究發現WTAP 在體外可促進葡萄糖攝取、乳酸產生和細胞外酸化率，敲除WTAP 可抑制體內腫瘤生長。LI 等[16]研究指出，高浸潤的Treg 細胞和CD4 記憶激活T 細胞可改善胃癌患者預后，WTAP 高表達可抑制免疫細胞產生，減少T 細胞浸潤并抑制腫瘤免疫，WTAP 低表達患者的淋巴細胞浸潤與患者良好預后相關，與本研究結論類似。

本研究顯示，Versican 陰性表達者的無病生存率高于陽性表達者，WTAP 陰性表達者的無病生存率也高于陽性表達者，再次印證癌組織Versican 及WTAP 表達與胃癌患者預后有關。HUANG 等[17]報道Versican 陽性表達的胃腺癌患者的生存期明顯短于Versican 陰性表達者；張捷等[18]研究顯示Versican 表達是胃癌患者預后不良的獨立風險因素；LI 等[19]研究顯示WTAP 通過CAV-1/NF-kappaB 軸促進子宮內膜癌進展；GUAN 等[20]研究顯示m6A 相關基因在胃癌中失調，WTAP 高表達增加了胃癌患者的預后不良風險；均與本研究結論類似，均提示Versican 及WTAP 蛋白表達與惡性腫瘤患者預后關系密切。

綜上所述，胃癌患者癌組織中Versican 及WTAP 蛋白表達與臨床病理特征及預后有關，Versican、WTAP 陽性表達患者術后復發轉移風險高。但由于本研究樣本量較小，未進一步統計Versican、WTAP 蛋白陽性高表達者及低表達者臨床病理特征及預后，后期將針對不足之處開展多中心、大樣本量試驗進一步完善。