甘草酸對大鼠急性肺水腫的影響*

雷艷麗，張俊，黎偉華，楊麗

（寧夏醫科大學 實驗動物中心，寧夏 銀川 750004）

急性肺損傷由膿毒癥、肺炎、急性胰腺炎及外傷等造成[1-2]。其伴有急性炎癥、微血管損傷，增加肺血管和上皮細胞通透性，引起呼吸衰竭，可能發展為致命性急性呼吸窘迫綜合征[3]。甘草作為經典的呼吸疾病治療中藥，具有鎮咳祛痰、治療咳嗽、支氣管炎等作用。甘草酸又名甘草甜素，是甘草的甜味成分亦是含量最高的苷類化合物[4]，主要用于抗肝炎病毒、抗艾滋病毒、抗癌、防癌、增強免疫力等領域[5-6]。有關研究表明，甘草酸保護急性肺損傷的主要機制是通過其類激素樣抗炎作用[7]，關于甘草酸對呼吸參數的影響尚未見到文獻報道。本研究擬通過氯化胺誘導大鼠急性肺損傷模型，觀察模型大鼠肺功能指標的變化，探討甘草酸對大鼠急性肺水腫的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DSI Buxco PFT 肺功能檢測儀（美國DSI 公司），ABS210S 電子天平（德國Sartorius 公司），ASP200S 全自動密閉組織脫水機、HistoCore Arcadia組織包埋機、RM2245 半自動石蠟切片機（德國Leica 公司），Milli-Q 超純水處理系統（美國Millipore公司）。甘草酸原料藥（批號JZ20131026，純度90%，南京景竹生物科技有限公司），氯化銨（批號20170806，上海光諾化學科技有限公司），0.9%氯化鈉注射液（山東科倫藥業有限公司），4%多聚甲醛溶液（北京雷根生物技術有限公司），實驗用水均為超純水。

1.2 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，18 只，6～8 周齡，體重180～220 g，購自寧夏醫科大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號SYXK（寧）2020-0001，實驗動物生產許可證號SCXK（寧）2020-0001。飼養環境溫度18～22℃，濕度40%～70%，保持自然晝夜節律光照（12 h/12 h），大鼠自由攝食飲水。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與藥物處理將大鼠隨機分為對照組、模型組、甘草酸預防組[8-9]。甘草酸組灌胃100 mg/kg 的甘草酸7 d，對照組和模型組口服灌胃等體積水。模型組和甘草酸組大鼠第8 天腹腔注射6%氯化胺（100 g/0.6 mL），復制急性肺水腫模型；對照組注射等體積生理鹽水。注射30 min 后，觀察各組大鼠的狀態、行為。

1.3.2 大鼠肺功能檢測待行為學觀察結束后，大鼠腹腔注射10%烏拉坦，麻醉后切開頸部皮膚，鈍性分離暴露氣管，氣管T 字開口并插管，采用手術縫合線結扎開口（保證密閉性），將大鼠放入肺功能儀自帶密閉腔體中，氣管插管與氣路連接，通過DSI Buxco PFT 肺功能檢測儀實時監測并記錄大鼠肺功能指標，包括一般指標[10-11]：肺功能殘氣量（FRC）、最大變化壓力（DPmax）、最大變化體積（DVmax）、阻塞時間（Tocclude）；肺內壓力-容積：靜態肺順應性（Cchord）、深吸氣量（IC）、肺活量（VC）；肺內呼氣流速-容積：最大呼氣流速（PEF）、用力肺活量（FVC）、用力呼吸殘氣量（FERV）和20 毫秒用力呼氣容積（FEV0.02）和100 毫秒用力呼氣容積（FEV0.1）。

1.3.3 動物取材打開大鼠胸腔，完整剪取肺組織，用預冷生理鹽水沖洗，使用濾紙吸干、拍照。再將肺組織分為左、右葉。右葉肺組織用4%多聚甲醛固定，蘇木精-伊紅（hematoxylineosin,HE）染色，左肺組織上葉用電子天平稱濕重后置于玻璃皿中測定肺含水量，左肺組織下葉于-80℃冰箱冷凍保存，用于其他指標的檢測[12-13]。

1.3.5 肺損傷及其肺水腫評估根據SD 大鼠肺葉組織的濕重/干重（W/D）評估肺水腫程度[14]。①濕重測量：取出處死大鼠右肺下葉組織，使用無菌紗布吸取表面組織液體，天平測量其濕重；②干重測量：將處理后的肺葉組織放入80℃恒溫烤箱烘烤48 h，待其衡重后稱重。肺組織含水率（%）=（肺組織濕重-肺組織干重）/肺組織濕重×100%。

1.3.6 肺組織病理學觀察取右葉肺組織，用4%多聚甲醛溶液固定，固定組織應充分展開，切勿擠壓和冷凍，室溫固定3 d后，切取肺組織塊2～4 mm，常規脫水，石蠟包埋、切片、HE 染色后，在光學顯微鏡下觀察大鼠肺泡間隔病變、炎癥細胞浸潤、血管瘀血狀況等組織病理學變化[12-13]。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 19 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺功能一般指標比較

各組大鼠FRC、DPmax、DVmax比較，差異有統計學意義（P＜0.05），模型組低于正常組和甘草酸組。各組大鼠Tocclude 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肺功能一般指標比較 （n=6，±s）

表1 各組大鼠肺功能一般指標比較 （n=6，±s）

組別正常組模型組甘草酸組F 值P 值FRC/mL 8.993±0.152 6.619±0.854 9.304±0.411 31.991 0.000 DPmax/cmH2O 34.013±1.119 18.729±1.586 19.967±0.844 167.552 0.000 DVmax/mL 0.340±0.009 0.128±0.041 0.202±0.012 59.501 0.000 Tocclude/s 5.533±0.173 6.608±0.193 5.977±0.724 1.255 0.320

2.2 各組大鼠肺內壓力-容積比較

各組大鼠肺Cchord、IC、VC 比較，差異有統計學意義（P＜0.05），模型組低于正常組、甘草酸組。見表2。

表2 各組大鼠肺內壓力-容積比較 （n=6，±s）

表2 各組大鼠肺內壓力-容積比較 （n=6，±s）

組別正常組模型組甘草酸組F 值P 值Cchord/（mL/cmH2O）1.443±0.039 0.737±0.253 0.964±0.014 18.404 0.000 IC/mL 18.961±0.491 11.813±1.425 12.896±0.096 60.780 0.000 VC/mL 21.730±0.397 13.242±1.835 15.650±0.080 50.522 0.000

2.3 各組大鼠肺內呼氣流速-容積比較

各組大鼠PEF、FVC、FERV、FEV0.1比較，差異有統計學意義（P＜0.05），模型組PEF、FERV、FEV0.1高于正常組，但低于甘草酸組，模型組FVC低于正常組、甘草酸組。各組大鼠FEV0.02比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠肺內呼氣流速-容積比較 （n=6，±s）

表3 各組大鼠肺內呼氣流速-容積比較 （n=6，±s）

組別正常組模型組甘草酸組F 值P 值PEF/（mL/s）81.349±2.769 100.833±7.358 118.473±1.490 57.679 0.000 FVC/mL 19.699±0.260 12.310±1.801 14.748±0.035 40.049 0.000 FERV/mL 0.228±0.095 0.649±0.343 1.912±0.102 67.949 0.000 FEV0.02/mL 0.574±0.384 0.766±0.373 1.014±0.022 2.564 0.118 FEV0.1/mL 6.790±0.684 8.350±1.258 10.157±0.081 16.449 0.000

2.4 各組大鼠肺組織變化

正常組大鼠呼吸均勻，無異常現象，解剖無異常。模型組注射6%氯化銨后，大鼠口角流出血色泡沫，解剖發現呼吸道內充滿泡沫液體，說明血漿透過肺血管進入呼吸道。模型組肺組織外形腫大，中間有淤血，部分肺組織邊緣還有明顯的損傷或壞死。甘草酸組大鼠口角未見太多泡沫，活動正常，解剖發現肺組織水腫程度明顯降低，出血點顯著減少或消失，且未見模型組中所觀察到的肺損傷或壞死現象。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織變化

2.5 各組大鼠W/D比較

正常組、模型組、甘草酸組大鼠肺組織含水率分別為（4.56±1.57）%、（7.83±0.86）%、（5.24±0.66）%，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=15.796，P=0.004），模型組高于正常組、甘草酸組。

2.6 各組大鼠肺組織的病理切片

正常組大鼠的肺組織結構完整、紋理清晰、肺泡腔完全無水腫，無特殊的改變。模型組大鼠肺中出現大量水腫，肺泡壁斷裂，肺泡隔顯著變大。口服甘草酸預防治療后，上述現象得到了改善。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織病理切片 （HE染色）

3 討論

氯化銨會引起心動過速，進而使得注入左心室的血液無法充分排出，逐漸增大其舒張期末壓力，導致右心房壓力提高而產生淤血于肺靜脈中。在過往研究中，肺水腫可致動物在呼吸過程中，產生難以消除的泡沫，泡沫形成速度快，嚴重影響呼吸，進而導致呼吸異常甚至致死[14-15]。所以清除呼吸道內的泡沫可減輕呼吸阻塞，改善呼吸，進而挽救生命。肺水腫是急性肺損傷最顯著的特征[16]。肺水腫導致的頑固性低氧血癥對患者影響嚴重，目前尚無有效的藥物治療，僅有小潮氣量肺保護性通氣和俯臥位通氣2 種方法有明顯療效[17-19]。

我國傳統中藥甘草的主要活性成分為甘草酸，其為五環三萜皂苷類。臨床上用于治療急性、慢性病毒性肝炎，可用于保肝等[20]。文獻報道，甘草酸對ALL 具有良好的保護作用，主要是通過降低肺水腫的致死率[5，21-23]。本研究發現，經甘草酸預防給藥的復制肺水腫模型大鼠肺部炎癥明顯緩解。甘草酸具有類激素樣受體的抗炎作用，文獻報道，糖皮質激素改善急性肺損傷小鼠肺功能，可以延緩氣道壓力升高，增加肺容積、氣道阻力、2 秒末用力呼氣容積、最大呼氣中期流速、用力最大呼氣流速，減少最大吸氣流量、最大呼氣中期時間[24-25]。

綜上所述，SD 大鼠給予氯化銨后，肺功能檢測儀可全面觀測到大鼠肺功能指標的變化。甘草酸可通過改善肺通氣量，減弱肺表面的水腫程度來緩解大鼠急性肺水腫，減少炎癥細胞浸潤。