基于HS-SPME-GC-MS和OAV分析黃山地區不同茶樹品種紅茶香氣的差異

楊霽虹，周漢琛，劉亞芹，王 輝，黃建琴，雷攀登

（安徽省農業科學院茶葉研究所，安徽 黃山 245000）

紅茶起源于中國，國內紅茶主要有祁紅、閩紅、滇紅、寧紅和英德紅茶等。紅茶經過萎凋、揉捻、發酵、干燥等工序制成，具有香高味甜、“紅湯紅葉”的特點。紅茶對人類疾病預防有一定作用，具有抗氧化、預防心血管疾病、慢性炎癥、肥胖、神經退行性疾病等功效，受到廣大消費者的青睞。

紅茶根據色澤、香氣和滋味的差異劃分不同等級，其中香氣是影響消費者對茶葉喜好的直觀判斷，它對茶葉感官品質的貢獻率達25%～40%。從化學成分角度看，紅茶特征性香氣化合物主要有香葉醇、芳樟醇及其氧化物、苯甲醇、2-苯乙醇、水楊酸甲酯、二氫獼猴桃醇酸內酯等。祁門紅茶以獨特的“似花似果似蜜”的“祁門香”，位列“世界三大高香紅茶”，主要以國家級茶樹良種-祁門櫧葉種的鮮葉為原料，特征性香氣成分以香葉醇、苯乙醛、芳樟醇、芳樟醇氧化物、2-己烯醛、己醛、苯甲醇、水楊酸甲酯等為主。

茶樹品種是決定香氣物質差異性和成茶香型的根本原因。銀飛燕等對湖南省栽種較多的5 個良種茶樹品種的內含物質等進行檢測，結合香氣和感官品質，探討了5 個品種制作紅茶，特別是高檔優質紅茶的可行性。朱蔭等分析了6 個茶樹良種制成龍井茶香氣成分的差異。羅學平等對5 個四川主栽品種紅茶香氣組分進行分析，結合萜烯指數與感官審評結果，鑒定出主體香氣成分對香型的分類。馬林龍等對湖北省6 個茶樹品系所制綠茶的香氣成分進行鑒定分析，鑒定出19 個香氣成分是所測樣品間的關鍵差異香氣成分。大多數研究圍繞品種適制性和不同品種制茶的香氣成分差異，然而，至今鮮見有研究表明黃山地區主要栽培茶樹品種差異對紅茶香氣成分的影響，以及與審評相結合，對不同茶樹品種制成的紅茶香型進行分類。

本實驗以黃山地區主要栽培的9 個茶樹品種鮮葉為原料，按祁門紅茶的加工工藝制備樣品，采用感官審評結合氣頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspacesolid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯用技術分析紅茶樣品的感官特征與香氣化合物的組成及含量，同時計算氣味活度值（odor activity value，OAV），利用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）和變量投影重要性（variable importance projection，VIP）分析紅茶樣品中的主要呈香化合物和關鍵差異香氣成分，以香氣為主導，討論不同茶樹品種鮮葉加工紅茶香氣的差異與香型分類，旨在為后續適制祁門紅茶茶樹品種的篩選和品質差異研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同品種紅茶樣品所用鮮葉為2020年4月采摘的‘翠綠1號’、‘鳧早2號’、‘皖茶4號’、‘舒茶早’、‘皖茶91’、‘中茶108’、‘祁門櫧葉種’、‘浙農117’、‘浙農139’，共9 個茶樹品種的新梢，采摘標準以一芽一葉初展為主，每個品種鮮葉約14～15 kg。除‘祁門櫧葉種’來自安徽祁門縣歷口鎮，其余品種均來自安徽省農業科學院茶葉研究所試驗基地的5 年生茶樹。

癸酸乙酯（純度99%） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭、萃取手柄 美國色譜科公司；7890-5975 GC-MS聯用儀、DB-5MS石英毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm） 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 茶樣制作

紅茶加工在安徽省農業科學院茶葉研究所加工車間完成。紅茶加工工藝流程與技術參數如下：鮮葉依次經過室內自然攤放（14～15 h、溫度13～15 ℃）、熱風萎凋（攤葉厚度8～10 cm、4～5 h、溫度35 ℃）、揉捻（空揉35 min、輕壓10 min、加壓15 min、重壓10 min）、解塊、發酵（溫度23～25 ℃、相對濕度95%、2.5～3 h）、毛火（120 ℃約7 min，烘至水分20%～30%）、攤涼（45 min）、足火（80 ℃約30 min，烘至水分4%～5%）制得紅茶樣品。樣品密封后貯存在－20 ℃冰箱待用。

1.3.2 感官審評方法

茶葉審評方法按照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》中紅茶審評方法進行感官審評。準確稱取茶樣3.00 g，置于150 mL審評杯中，沸水沖泡5 min后出湯，由3 位專業審評人員對香氣進行描述與評分，評分標準為百分制。

1.3.3 香氣組分的萃取

采用HS-SPME萃取香氣組分。準確稱取1.00 g研磨的紅茶樣置于固相微萃取瓶中，加入1.00 g NaCl和20.00 mL沸水，立即密封瓶口，60 ℃平衡5 min，加入20.00 μL 0.04%癸酸乙酯溶液，將萃取頭立即插入萃取瓶，與液面維持一定高度后，于50 ℃恒溫水浴鍋中萃取30 min，萃取結束后，將萃取頭插入GC-MS進樣口（230 ℃）解吸附5 min后進行香氣組分分析。每個樣品重復3 次。

1.3.4 香氣組分的解析

GC儀進樣口溫度為250 ℃，不分流進樣，載氣為高純氦氣，純度為99.99%；柱溫程序：40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升至85 ℃，保持2 min；以2 ℃/min升至110 ℃，保持1 min；以3 ℃/min升至128 ℃，保持1 min；以2 ℃/min升至145 ℃，保持2 min；以12 ℃/min升至260 ℃，保持6 min；總程序時間為59.583 min。

1.3.5 香氣成分數據處理及質譜檢索

茶葉香氣經GC-MS分析，各組分質譜數據輸入計算機庫進行檢索匹配，對基峰、質荷比和相對峰度等方面進行分析。以癸酸乙酯作為內標物，計算香氣化合物的含量。

1.3.6 OAV計算

對各種揮發性化合物定量后，依據參考文獻中各揮發性物質在水中的氣味閾值，OAV計算公式如下：

式中：OAV為物質的香氣活性值；C為化合物在茶樣中的含量/（μg/kg）；OT為組分在水中的氣味閾值/（μg/kg）。當OAV大于1時，則認定該組分對茶葉呈香具有重要貢獻。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 不同茶樹品種紅茶香氣的感官審評分析

茶樹是高度雜合物種，品種間遺傳背景差異較大，導致不同茶樹品種間代謝物積累存在差異。有研究表明，紅茶香氣與茶樹品種有密切的關系，品種不同，紅茶的香氣特征明顯不同。本研究以栽種于黃山地區的9 個茶樹品種為原料制備成紅茶樣品并進行相關分析，其中‘祁門櫧葉種’為有性系茶樹品種，是祁門紅茶加工原料的主要來源；‘皖茶4號’和‘鳧早2號’2 個茶樹品種由祁門本地群體種選育；‘翠綠1號’由黃山本地群體種選育；‘皖茶91’和‘舒茶早’為安徽省內選育品種；‘浙農139’、‘中茶108’和‘浙農117’ 3 個茶樹品種為外省選育品種引種至黃山地區。

通過對供試茶樹品種鮮葉制成的紅茶樣品的香氣感官審評（表1），9 個紅茶樣品主導香氣類型均為甜香型，其中‘祁門櫧葉種’紅茶具有典型的“祁門香”，香氣馥郁高昂、花香明顯，得分最高；‘皖茶4號’紅茶甜香高爽且略帶花香，但花香強度低于‘祁門櫧葉種’紅茶；其余7 個品種紅茶甜香明顯，而花香顯著低于‘祁門櫧葉種’紅茶和‘皖茶4號’紅茶。‘翠綠1號’紅茶雖以甜香為主導，但該紅茶具有其特殊香氣，略帶有品種香，似紅糖香氣，但香氣鮮爽度不高，故而評分較低。‘鳧早2號’紅茶甜香較為馥郁，與‘舒茶早’、‘皖茶91’、‘中茶108’、‘浙農139’4 類紅茶雖甜香類型略有差異，但香氣鮮爽度差異不大，所以評分相同。

表1 不同茶樹品種紅茶香氣感官審評Table 1 Sensory evaluation of aroma in black tea samples

2.2 不同茶樹品種紅茶香氣成分分析

為研究9 個茶樹品種制成紅茶的香氣差異，利用GC-MS儀對紅茶樣品的揮發性化合物成分及相對含量進行分析鑒定。由表2可知，共檢測到46 個主要揮發性成分，其中33 個成分為共有成分，共檢測到醇類化合物14 種、酯類化合物8 種、醛類化合物11 種、烯類化合物7 種、酮類化合物2 種、芳香族化合物3 種和其他類1 種。其中‘祁門櫧葉種’（23 586.68 μg/kg）的香氣總量最高，其次是‘皖茶4號’（10 444.20 μg/kg）和‘翠綠1號’（7 302.01 μg/kg）。芳樟醇及其氧化物、水楊酸甲酯、香葉醇在樣品中含量較高，品種間差異較大。已有研究表明，芳樟醇及其氧化物、香葉醇、苯甲醇、苯乙醇、水楊酸甲酯等是紅茶特征性香氣物質，與本研究結果相符。

不同茶樹品種鮮葉制成的茶葉因其香氣化合物及其含量的不同，表現出不同的香型。有研究報道祁門紅茶中香葉醇含量較高，因而祁紅具有濃郁的“玫瑰花香”；芳樟醇及其氧化物也具有玫瑰花香和果香。供試的9 個紅茶樣品主要香氣化合物含量差異較大，如香葉醇在‘祁門櫧葉種’（（2 280.93±646.02）μg/kg）和‘皖茶4號’（（2 823.23±333.83）μg/kg）品種中的含量較高，與含量最低的‘浙農139’（（57.60±5.13）μg/kg）相差約40 倍；芳樟醇在‘祁門櫧葉種’（（5 161.20±1 922.66）μg/kg）、‘翠綠1號’（（2 174.85±322.06）μg/kg）、‘皖茶4號’（（1 711.49±128.50）μg/kg）和‘浙農117’（（1 332.35±477.33）μg/kg）品種中含量較高，與其他品種相差約2～44 倍；水楊酸甲酯在‘祁門櫧葉種’（（3 239.56±342.29）μg/kg）、‘翠綠1號’（（1 781.69±159.69）μg/kg）和‘皖茶4號’（（1 719.06±111.90）μg/kg）品種中的含量顯著高于其他品種，特別是‘皖茶91’、 ‘中茶108’和‘浙農139’。含量較低的()--紫羅酮對紅茶香氣的形成也有較大的貢獻，各品種間的含量相差較小。

2.3 不同茶樹品種紅茶香氣化合物種類及含量分析

9 個茶樹品種紅茶樣品中共分析出46 種揮發性香氣化合物，由圖1可知，醇類、酯類和醛類占香氣成分總量的75.76%～89.59%。

醇類化合物占香氣成分總量的36.79%～55.19%，主要為糖苷類的水解、氨基酸和脂肪酸代謝產物，其中相對含量較高的醇類化合物為芳樟醇及其氧化物和香葉醇。芳樟醇似花香、似檸檬香，芳樟醇氧化物似甜花香、檸檬香、果香，香葉醇似花香、似玫瑰香。從比例可明顯看出，‘浙農117’中的醇類化合物占比較高，含量最高的為芳樟醇。

酯類化合物占香氣成分總量的19.00%～29.65%，主要來源于氨基酸和脂肪酸的代謝。含量最高的水楊酸甲酯具有明顯的冬青油味、薄荷香，‘皖茶91’和‘浙農139’中酯類化合物含量較高于其他品種。

醛類化合物占香氣成分總量的9.39%～24.95%，主要來自于脂肪酸、氨基酸等代謝途徑，以己醛、2-己烯醛、庚醛、苯甲醛、苯乙醛、壬醛、檸檬醛為主。己醛具有青氣、青草氣，2-己烯醛具有青氣、果香，庚醛具有柑橘香、脂香，苯甲醛具有苦杏仁、櫻桃及堅果香，苯乙醛具有果香和甜香，壬醛具有玫瑰香和柑橘香，檸檬醛具有檸檬香。‘浙農139’、‘中茶108’、‘舒茶早’和‘皖茶4號’中醛類化合物占比較高。

酮類化合物占香氣成分總量的比例較小，以類胡蘿卜素降解產物最多。共檢測到兩種酮類化合物，6-甲基-5-庚烯-2-酮和()--紫羅酮。()--紫羅酮具有木香、似紫羅蘭香，對紅茶的香氣貢獻較大。

烯類化合物主要以-月桂烯、檸檬烯和()--羅勒烯為主。-月桂烯具有花香、果香，檸檬烯具有檸檬香、草香，()--羅勒烯具有草香、花香。芳香烴化合物主要以對二甲苯為主，其具有堅果味，油脂味。‘祁門櫧葉種’中的芳香烴類含量高達14.62%，與其他品種差異顯著。不同茶樹品種鮮葉制成的紅茶中各香氣物質種類和比例的差異，構成了不同的干茶香氣。

圖1 不同茶樹品種紅茶香氣化合物的類型及比例Fig. 1 Types and proportions of aroma compounds in black tea samples

2.4 不同品種紅茶香氣成分的OAV分析

OAV代表單一的香氣成分對整體香氣的貢獻程度，因此在風味研究中得到廣泛應用。一般認為OAV大于1的成分可能對總體風味有直接影響。根據HS-SPME-GCMS的定性、定量結果，通過文獻查找對應香氣化合物在水中的閾值，并計算其OAV，計算出9 個紅茶樣品中共

21 個OAV大于1的香氣化合物，分別為己醛、()-2-己烯醛、()-3-己烯醇、庚醛、庚醇、1-辛烯-3-醇、月桂烯、檸檬烯、()--羅勒烯、苯乙醛、芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II、芳樟醇、壬醛、壬醇、水楊酸甲酯、癸醛、-環檸檬醛、香葉醇、檸檬醛、()--紫羅酮，結果如表3所示。紅茶樣品中關鍵香氣化合物的OAV雖有差異，但所有樣本中芳樟醇和()--紫羅酮的OAV均遠高于其他香氣化合物。芳樟醇在所樣本中含量較高，而它的香氣閾值低，所以在樣本中表現出較高的OAV。()--紫羅酮被認為是決定紅茶特性的關鍵香氣，在所有樣本中含量雖然很低，但由于其香氣閾值也非常低，所以在樣本中表現出較高的OAV。

表2 不同茶樹品種紅茶香氣成分及含量Table 2 Types and contents of volatile compounds in black tea samples

由表3可知，除芳樟醇和()--紫羅酮為關鍵呈香物質，己醛、()-3-己烯醇、庚醛、1-辛烯-3-醇、月桂烯、壬醛、水楊酸甲酯和香葉醇在所有樣本中OAV均大于1，特別是在‘皖茶4號’、‘翠綠1號’和‘舒茶早’紅茶中多個化合物的OAV大于100，推測這些揮發性化合物對紅茶香氣的形成具有重要貢獻。

表3 不同茶樹品種紅茶主要香氣化合物OAVTable 3 OAVs of major volatile compounds in different black tea samples

2.5 不同茶樹品種紅茶香氣成分的OPLS-DA及VIP分析

OPLS-DA屬于有監督分析，可通過預設分類，盡可能去除未控制變量對數據造成的影響，可進一步挖掘數據信息，同時可以量化特征風味物質造成樣品之間差異的程度，減少結果誤差。將紅茶香氣成分的OAV作為變量進行OPLS-DA（圖2），結果顯示，‘翠綠1號’、‘鳧早2號’、‘舒茶早’、‘皖茶91’、‘中茶108’、‘浙農117’、‘浙農139’聚為一類，表明這7 個紅茶樣品中的香氣化合物對香氣的總體貢獻有一定的相似性，而‘皖茶4號’和‘祁門櫧葉種’分別單獨聚為一類，表明這2 個紅茶樣品中的香氣化合物對香氣的總體貢獻互有差異，也有別于其他7 個樣品。

圖2 不同茶樹品種紅茶香氣化合物的OPLS-DAFig. 2 OPLS-DA plot of aroma compounds in black tea samples

利用OPLS-DA形成的VIP值的大小進行關鍵變量分析，一般來說，VIP值大于1的變量被認為是導致組間差異的代謝物，紅茶香氣品質取決于多個香氣化合物共同作用的結果。因其他7 類紅茶PCA聚為一類，本研究選取‘皖茶91’為對照，分別與‘祁門櫧葉種’和‘皖茶4號’進行比較，篩選VIP值大于1的化合物（表4）。結合感官審評結果，發現可能導致‘祁門櫧葉種’紅茶“祁門香”和‘皖茶91’紅茶甜香香氣差異的化合物主要是()--紫羅酮、芳樟醇、-月桂烯、香葉醇、己醛、壬醛和庚醛；可能導致‘皖茶4號’紅茶花香和‘皖茶91’紅茶甜香香氣差異的化合物主要是()--紫羅酮、香葉醇、-月桂烯、芳樟醇和己醛。

表4 不同茶樹品種紅茶香氣化合物VIP值分析Table 4 VIP values of aroma compounds in black tea samples

3 結 論

從感官審評結果看，9 個茶樹品種鮮葉制成的紅茶樣品香氣香型均為甜香型，其中‘祁門櫧葉種’具有典型的“祁門香”，花香明顯；‘皖茶4號’香氣近似‘祁門櫧葉種’，其余品種紅茶甜香明顯，而花香顯著低于‘祁門櫧葉種’。9 個紅茶樣品香氣化合物以醇類、醛類和酯類為主，‘翠綠1號’、‘皖茶4號’、‘祁門櫧葉種’紅茶樣香氣總量遠高于其他品種，芳樟醇及其氧化物、水楊酸甲酯、香葉醇為所有紅茶樣中含量較高的香氣化合物。共有21 種香氣化合物對紅茶風味有一定貢獻，其中芳樟醇和()--紫羅酮貢獻較大。

多數研究以揮發性化合物的含量為評價指標進行OPLS-DA，但有些揮發性化合物雖然含量高，但閾值也高，不易被人的嗅覺感知，本研究以OAV作為評價指標進行分析更加有說服力。‘皖茶4號’和‘祁門櫧葉種’對紅茶香氣的總體貢獻互有差異也有別于其余7 個紅茶樣，分析結果與審評結果相似，造成‘祁門櫧葉種’紅茶有別于其他品種紅茶的主要香氣化合物可能是()--紫羅酮、芳樟醇、-月桂烯、香葉醇、己醛、壬醛和庚醛，這些香氣化合物閾值低，且具有花果香，這些成分含量和比例的差異，可能是‘祁門櫧葉種’紅茶特殊甜花香有別于其他品種紅茶甜香的主要因素。有研究對歷口地區群體種紅茶香氣進行檢測，指出香氣主要成分為香葉醇、苯乙醛、芳樟醇、芳樟醇氧化物、2-己烯醛、己醛、苯甲醇和水楊酸甲酯，與本研究結果相似，但也有研究結果指出祁紅特征性香氣成分為香葉醇、芳樟醇及其氧化物、苯甲醇、植醇、苯乙醛、2-己烯醛、十六酸等，與本實驗結果略有差別，這可能與原料、加工工藝、香氣提取方法以及檢測手段有關。

‘皖茶4號’是由祁門櫧葉種選育出的無性系良種，制成紅茶的香氣以甜香為主，稍帶花香。與其余7 個品種紅茶樣的主要差異香氣化合物可能是()--紫羅酮、香葉醇、-月桂烯、芳樟醇和己醛。