牛肉干法成熟過程揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化規(guī)律

劉 夢，張順亮，臧明伍，趙 冰，黃卉佳，朱 寧，李 素，吳倩蓉，劉博文，趙 燕，喬曉玲，王守偉

（中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

肉的成熟是指將新鮮或冷凍的肉類放在特定溫度、濕度條件下貯藏一段時間的過程。目前，常見的成熟方式有濕法成熟和干法成熟。濕法成熟是將肉放在真空包裝袋中，在運輸和銷售的過程中完成成熟過程。干法成熟是將肉放在－1.5～4 ℃，相對濕度為85%條件下，貯藏一段時間以完成成熟過程。隨著成熟時間的延長，干法成熟的肉表面會失水，同時會被氧化，有的肉表面還會有微生物附著。而濕法成熟的肉因其被包裹在真空袋中，有效抑制了牛肉氧化和微生物生長。但是，大量研究表明，干法成熟的牛肉所產(chǎn)生的風味優(yōu)于濕法成熟，這也是近幾年干法成熟肉深受消費者歡迎的原因之一。

近年來，許多學者對干法成熟和濕法成熟牛肉的感官進行了比較分析。大多數(shù)研究表明干法成熟牛肉的感官評分更高，且其具有更濃的牛肉味和燒烤味，也有部分研究認為干法成熟的牛肉鮮味和油炸味較濃。干法成熟牛肉的揮發(fā)性風味物質(zhì)的形成主要分為2 種途徑，一是脂質(zhì)氧化與降解，二是氨基酸與還原糖之間發(fā)生的美拉德反應。目前，針對干法成熟牛肉風味的研究多集中于對比不同成熟方式對牛肉風味等品質(zhì)的影響，而關(guān)于干法成熟過程牛肉揮發(fā)性風味物質(zhì)變化規(guī)律的研究較少，不能對干法成熟牛肉加工形成有效參考。

本研究以牛上腦肉為原料，采用電子鼻、氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用儀等分析儀器和方法，研究干法成熟過程牛肉揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化規(guī)律，以探究干法成熟過程不同階段牛肉揮發(fā)性風味物質(zhì)的相似性及差異，為牛肉干法成熟技術(shù)的開發(fā)與應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛上腦肉 河北福成五豐食品股份有限公司；2-甲基-3-庚酮（純度99%）、C～C系列正構(gòu)烷烴 美國西格瑪公司。

1.2 儀器與設(shè)備

牛肉干法成熟設(shè)備由中國肉類食品綜合研究中心自主研發(fā)；PEN3便攜式電子鼻 德國Airsense公司；TRACE 1310型氣相色譜-TSQ 8000型質(zhì)譜儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將牛上腦肉在4 ℃冷庫中解凍至中心溫度達到0 ℃后，將其分割成大小約為25 cm×15 cm×15 cm均勻的肉塊。放入干法成熟設(shè)備中進行成熟，成熟條件為4 ℃、相對濕度85%，成熟時間為28 d。具體實驗條件見表1。

表1 實驗條件Table 1 Experimental conditions for each group

1.3.2 電子鼻檢測

準確稱取1.5 g樣品于樣品瓶中，50 ℃平衡5 min，使用電子鼻進行檢測。傳感器相應信號在68 s后趨于穩(wěn)定，選取70～75 s進行分析，每組樣品做5 次平行。

1.3.3 揮發(fā)性風味物質(zhì)的固相微萃取

固相微萃取方法參考文獻[8]。稱取（3.00±0.05）g樣品置于固相微萃取小瓶中，加入1 μL 0.816 μg/μL 2-甲基-3-庚酮標品，旋緊蓋子，放入50 ℃水浴鍋中平衡10 min，然后將固相微萃取針頭插入瓶中，于頂空狀態(tài)吸附40 min。

1.3.4 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

氣相色譜-質(zhì)譜方法參考文獻[9]。

氣相色譜條件：TG-Wax MS極性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（純度＞99.99%）；流速1.0 mL/min；采用不分流模式，保持2 min。升溫程序：柱起始溫度40 ℃，保持3 min，之后以5 ℃/min速率升溫到200 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min速率升溫到220 ℃，保持3 min。進樣口溫度250 ℃。

質(zhì)譜條件：電子電離源；傳輸線溫度230 ℃；電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍40～600 u，全掃描模式。

1.3.5 揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

定性分析：根據(jù)所得譜圖與NIST數(shù)據(jù)庫提供的譜圖對風味物質(zhì)定性分析，選取正反匹配度均大于800的化合物。通過系列正構(gòu)烷烴計算待測化合物保留指數(shù)（retention index，RI），并與文獻進行比對。RI按式（1）計算：

式中：為樣品的保留時間/min（在正構(gòu)烷烴C和C之間）；t、t分別為正構(gòu)烷烴C、C的保留時間/min。

定量分析：根據(jù)內(nèi)標2-甲基-3-庚酮的含量及峰面積對揮發(fā)性風味物質(zhì)進行半定量分析，按式（2）計算：

式中：C為待測化合物含量/（μg/kg）；為內(nèi)標物質(zhì)量濃度（0.816 μg/μL）；為內(nèi)標物進樣體積/μL；S為待測化合物的峰面積/（AU·min）；為內(nèi)標物峰面積/（AU·min）；為樣品取樣質(zhì)量/kg。

1.3.6 嗅聞檢測

參考文獻[10]的方法。樣品中揮發(fā)性風味物質(zhì)經(jīng)氣相色譜分離后分別進入質(zhì)譜檢測器和嗅聞檢測器，分流比為1∶1，嗅聞傳輸線溫度為200 ℃。選取3 名嗅覺靈敏并經(jīng)過專業(yè)培訓的人員在嗅聞口進行嗅聞，記錄聞到的氣味、保留時間、氣味特征和氣味強度。強度分為5 個等級（1＝氣味非常微弱、2＝氣味微弱、3＝氣味中等、4＝氣味強烈、5＝氣味非常強烈）。每種風味化合物的氣味描述以及時間需由至少2 名評價員確認一致，則將該描述記為最終實驗結(jié)果。

1.3.7 相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）計算

參考文獻[11]，按式（3）計算：

式中：C為揮發(fā)性風味物質(zhì)含量/（μg/kg）；T為該揮發(fā)性成分嗅覺閾值/（μg/kg）；為氣味貢獻最大揮發(fā)性風味物質(zhì)的閾值/（μg/kg）；為氣味貢獻最大揮發(fā)性風味物質(zhì)含量/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel對數(shù)據(jù)進行平均值、標準差等計算；使用Origin 8.0繪制柱狀圖；使用SPSS 21.0進行差異顯著性分析，＜0.05，差異顯著，＜0.01，差異極顯著；使用Heatmapper網(wǎng)絡(luò)在線軟件進行二維聚類分析，并繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉干法成熟過程電子鼻的線性判別分析結(jié)果

圖1 電子鼻LDAFig. 1 LDA plot of electronic nose data

由圖1可知，LD1和LD2的貢獻率分別為95.71%和2.34%，總貢獻率為98.05%。圖中各組樣品間無重疊區(qū)域，說明線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）分析可將不同干法成熟階段的牛肉區(qū)分開。0 d和7 d牛肉在LD1上區(qū)別不明顯，在LD2上區(qū)別明顯，LD1代表了樣品95.71%的特征信息，說明0 d和7 d牛肉的揮發(fā)性風味變化較小。14、21 d和28 d牛肉與0 d和7 d牛肉在LD1上區(qū)別明顯，說明干法成熟14 d以后牛肉的揮發(fā)性風味發(fā)生了顯著性變化。

2.2 牛肉干法成熟過程揮發(fā)性風味物質(zhì)的組成分析

圖2 揮發(fā)性風味物質(zhì)含量及數(shù)量Fig. 2 Contents and types of volatile flavor compounds in different samples

由圖2可知，未經(jīng)成熟的牛肉其揮發(fā)性風味物質(zhì)種類最少，為39 種。隨著干法成熟的進行，檢測到的揮發(fā)性風味物質(zhì)種類呈先上升后下降的變化趨勢，分別為46、50、53 種和45 種。這可能是因為干法成熟過程牛肉蛋白質(zhì)和脂肪被內(nèi)源酶逐漸降解，使得揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類增多。成熟28 d時，牛肉中酯類物質(zhì)種類減少（成熟21 d時為11 種，成熟28 d時為5 種），這可能是因為隨著成熟的進一步進行，酯類物質(zhì)發(fā)生降解，導致其種類減少，進而導致成熟28 d時揮發(fā)性風味物質(zhì)種類減少。未經(jīng)成熟的牛肉其揮發(fā)性風味成分含量最低，為（847.13±9.10）μg/kg。而隨著成熟的進行，揮發(fā)性風味物質(zhì)含量呈上升趨勢，分別為（1 059.70±11.29）、（1 218.05±3.19）、（1 383.95±37.95）μg/kg和（2 719.27±44.19）μg/kg，其中成熟28 d時，揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量達到最大，是未經(jīng)干法成熟牛肉揮發(fā)性風味物質(zhì)含量的3.21 倍，是成熟21 d揮發(fā)性風味物質(zhì)含量的1.96 倍。說明隨著干法成熟的進行，揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量逐漸增多。其中，醇類物質(zhì)和酮類物質(zhì)含量整體呈上升趨勢；酸類物質(zhì)呈先下降后上升的趨勢；醛類物質(zhì)呈上升趨勢；酯類物質(zhì)呈先上升后下降的趨勢。這可能是因為成熟前期牛肉內(nèi)源酶將脂肪和蛋白質(zhì)降解，同時脂肪發(fā)生氧化，生成醇類、酮類、醛類和酯類物質(zhì)，導致這些物質(zhì)含量上升。隨著成熟的進行，醇類物質(zhì)氧化生成酮類物質(zhì)，醇類物質(zhì)含量小幅度減少，而伴隨著脂肪繼續(xù)氧化，醇類物質(zhì)后期含量增加；同時蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物發(fā)生Strecker反應，以及微生物的作用，導致醛類物質(zhì)在成熟后期含量增加；而酮類物質(zhì)主要由脂肪氧化、醇類物質(zhì)氧化和酯類物質(zhì)降解得到，在成熟過程中其含量處于波動變化狀態(tài)，同時由于酯類物質(zhì)的降解，導致后期酯類物質(zhì)含量減少；酸類物質(zhì)初期含量較高，這可能是由于所使用的原料肉未經(jīng)成熟產(chǎn)酸造成的，在成熟過程中相當于先進行了成熟產(chǎn)酸過程，導致酸類物質(zhì)含量下降，后期由于氨基酸Strecker反應、酯類物質(zhì)降解以及酵母菌的生長導致酸類物質(zhì)含量上升。

2.3 牛肉干法成熟過程揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量變化

圖3 揮發(fā)性風味物質(zhì)含量變化熱圖及聚類分析Fig. 3 Cluster heatmap of volatile flavor compounds

為直觀表達不同成熟時間樣品中揮發(fā)性風味物質(zhì)含量的變化，對檢測到的揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量變化進行熱圖分析，如圖3所示。紅色越深代表該揮發(fā)性風味物質(zhì)含量越高，藍色越深代表該揮發(fā)性風味物質(zhì)含量越低。有31 種揮發(fā)性風味物質(zhì)隨著成熟時間的延長含量增加，如異丁醇、苯甲醛、十三烷、十四烷、3-辛酮、2-乙基-1-己醇、芳樟醇、苯甲醇、萘、正戊酸、2,3-丁二酮、2-庚酮、2-壬酮、正己酸乙酯、辛酸乙酯等。異丁醇被認為是釀酒酵母發(fā)酵果酒中的重要香味物質(zhì)。苯甲醛具有杏仁味和焦糖味，可由微生物利用支鏈氨基酸降解產(chǎn)物得到，在霉菌發(fā)酵的食品中常被檢出，說明成熟后期牛肉表面微生物的生長對牛肉風味的形成具有促進作用。2,3-丁二酮、2-庚酮、3-辛酮、正己酸乙酯、辛酸乙酯這些具有黃油味、肥皂味、水果味、脂肪味等氣味的風味物質(zhì)氣味閾值較低，可能對成熟后期牛肉的風味產(chǎn)生較大的影響。

有10 種風味物質(zhì)含量逐漸減少或在后期未被檢測到，主要為醇類、酸類和烴類，如正戊醇、反式-2-辛烯-1-醇、正己酸、十五烷等，隨著成熟的進行這些物質(zhì)易被氧化或相互反應生成酯類等物質(zhì)，因而其在成熟過程中含量逐漸降低。

有43 種風味物質(zhì)含量呈先上升后下降的變化趨勢，如丙位辛內(nèi)酯、十一醇、異戊醇、1-辛烯-3-醇、1-壬醇、4-異丙基甲苯、仲辛酮、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、乙醇、壬醛、癸醛、十二醛等，其中異戊醇由亮氨酸生成，并帶有香蕉果香，是韓國果酒和日本米酒里重要的香味物質(zhì)；壬醛具有哈喇味、魚腥味，是油酸的氧化產(chǎn)物；1-辛烯-3-醇是亞油酸的氫過氧化物降解產(chǎn)物，具有蘑菇香氣和草香味。成熟過程中內(nèi)源酶分解蛋白質(zhì)生成小分子物質(zhì)，如氨基酸等，因此由氨基酸參與形成的風味物質(zhì)在成熟一段時間后才會被檢測出；油酸是單不飽和脂肪酸，通常在多不飽和脂肪酸被氧化后才會被氧化；而亞油酸氫過氧化物的形成和降解也需要在成熟過程中進行，因此以這些物質(zhì)為前體物的風味物質(zhì)在成熟過程進行一段時間后才會生成，因而這些物質(zhì)的含量出現(xiàn)上升的趨勢，后期隨著成熟的進行，醇類物質(zhì)被氧化導致其含量下降。

2.4 牛肉干法成熟過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)的聚類分析

如圖3所示，不同成熟時間牛肉風味物質(zhì)存在差異。未經(jīng)成熟和成熟7 d牛肉在最小水平上形成一個小類，說明兩者之間具有較大的相似性；成熟14 d和成熟21 d的牛肉在最小水平上也形成一個小類，說明兩者之間同樣具有相似性；隨著歐式距離的增大，這兩個小類聚為一類，說明未經(jīng)成熟和成熟7 d與成熟14 d和成熟21 d牛肉之間具有較大的差異；當歐式距離再次增大時，成熟28 d的牛肉才與其他成熟樣品聚為一類，說明成熟28 d牛肉其揮發(fā)性風味物質(zhì)差異最大。由此可以大致將成熟過程揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化分為3 個階段：成熟7 d為第1階段；成熟7 d～21 d為第2階段；成熟21～28 d為第3階段。這與Watanabe等的研究結(jié)果一致。

2.5 牛肉干法成熟過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)的ROAV

ROAV可以衡量揮發(fā)性風味物質(zhì)中對整體風味有總要貢獻的物質(zhì)，一般認為ROAV越大，該物質(zhì)對總體風味的貢獻越大。ROAV不小于1的物質(zhì)為關(guān)鍵風味物質(zhì)，ROAV介于0.1至1之間的物質(zhì)對總體風味有重要的修飾作用。表2列出了牛肉干法成熟過程中ROAV不小于1的揮發(fā)性風味物質(zhì)及其含量。由表2可知，異戊醇、2-庚醇、1-辛烯-3-醇、1-壬醇、壬醛、鄰-異丙基苯、2,3-丁二酮、正己酸乙酯在成熟過程中對牛肉整體風味貢獻較大，這些物質(zhì)主要具有威士忌酒、麥芽味、燒焦味、蘑菇味、脂肪味、青草味、柑橘味、黃油味、蘋果皮味及果香味。癸醛、十二醛、2-庚酮、3-辛酮隨著成熟時間延長，其ROAV越大，這些物質(zhì)主要由脂肪氧化得到，具有脂肪味、肥皂味和黃油味，說明成熟過程中脂肪發(fā)生氧化，促進牛肉風味物質(zhì)的形成。值得注意的是，異戊酸乙酯、癸酸乙酯和丙位辛內(nèi)酯在成熟中期被檢測到，而在前期和后期未被檢測到，這可能是因為成熟前期，脂肪水解產(chǎn)生的脂肪酸與脂肪氧化產(chǎn)生的醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應生成酯類物質(zhì)；后期酯類物質(zhì)降解，與氨基酸反應生成其他風味物質(zhì)，導致其未被檢測出。

表2 成熟過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)含量及ROAVTable 2 Contents and ROAV of volatile flavor compounds in beef during the dry-aging process

2.6 牛肉干法成熟過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)的嗅聞結(jié)果

表3 GC-O法鑒定成熟過程中牛肉的香氣特征Table 3 Aroma characteristics of beef during the dry-aging process by determined by GC-O

由表3可知，牛肉成熟過程中分別檢測到7、9、11、11 種和9 種香氣成分。其中，異戊醇、2,3-丁二酮和正乙酸乙酯在整個成熟過程中香氣強度均較大，呈酒香、麥芽香、黃油味、蘋果皮和水果味，奠定了牛肉成熟過程中的風味基調(diào)。而在未經(jīng)成熟的牛肉中乙酸異戊酯的香氣強度同樣較大，呈香蕉味；成熟7～21 d牛肉中檢測到了癸酸乙酯和丙位辛內(nèi)酯，其中癸酸乙酯的香氣強度較大，呈葡萄味；除此之外，成熟14 d牛肉中異戊酸乙酯和乙酸異戊酯的香氣強度較大，呈香蕉味和水果味，且異戊酸乙酯是成熟14 d特有的關(guān)鍵風味物質(zhì)；成熟21 d牛肉中2-庚酮的香氣強度較大，呈肥皂味；成熟28 d的牛肉中癸醛和十二醛的香氣強度較大，呈脂肪味、青草味和肥皂味。與ROAV的檢測結(jié)果一致。

對比成熟過程中牛肉的香氣特征和ROAV可以發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)成熟的牛肉中異戊醇、2,3-丁二酮、乙酸異戊酯和正己酸乙酯是其關(guān)鍵風味物質(zhì)；成熟7 d的牛肉中異戊醇、正己酸乙酯和癸酸乙酯是其關(guān)鍵風味物質(zhì)；成熟14 d牛肉中異戊醇、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯和癸酸乙酯是其關(guān)鍵風味物質(zhì)；成熟21 d牛肉中異戊醇、2-庚酮、正己酸乙酯和癸酸乙酯是其關(guān)鍵風味物質(zhì)；成熟28 d牛肉中異戊醇、癸醛、十二醛和正己酸乙酯是其關(guān)鍵風味物質(zhì)。從整體風味看，隨著成熟的進行，成熟前期關(guān)鍵風味以果香味為主，同時具有酒香味、麥芽味和黃油味；而成熟后期由于脂肪氧化的加重，關(guān)鍵風味以脂肪味為主，兼具果香味、酒香味和麥芽味。這與Campo等的研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

通過電子鼻結(jié)合氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用儀對牛肉干法成熟過程揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化進行研究。結(jié)果表明，不同成熟階段牛肉揮發(fā)性風味物質(zhì)有較好的區(qū)分度；隨著成熟時間的延長，風味物質(zhì)含量顯著上升，在成熟28 d時，其揮發(fā)性風味物質(zhì)含量是未經(jīng)成熟牛肉的3.21 倍，說明干法成熟有利于牛肉風味的形成；通過風味物質(zhì)的聚類分析可將成熟過程大致分為3 個階段，成熟0～7 d為第1階段，該階段牛肉風味差別不大；成熟14～21 d為第2階段，此階段與第1階段揮發(fā)性風味具有較大差異，但階段內(nèi)揮發(fā)性風味差異不大；成熟28 d為第3階段，此階段與前兩個階段揮發(fā)性風味物質(zhì)含量變化最大；通過ROAV和香氣特征分析，發(fā)現(xiàn)異戊醇和正己酸乙酯是整個成熟過程中的關(guān)鍵風味物質(zhì)，呈酒香味、麥芽味和果香味。同時每個成熟時期存在其他關(guān)鍵風味物質(zhì)，癸醛和十二醛在成熟28 d時被檢測為新的關(guān)鍵風味物質(zhì)，使得牛肉整體風味以脂肪味為主。

綜上，本實驗通過對干法成熟過程牛肉揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化分析，初步明確了干法成熟過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化規(guī)律，后續(xù)將對成熟過程中蛋白質(zhì)、脂肪及微生物的變化進行分析，為牛肉成熟技術(shù)的開發(fā)和應用提供理論依據(jù)。