芒果采后炭疽病生防菌研究進展

趙 佳，童 凱，李 東，鄧孟勝，雷 雨

（四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644000）

素有“熱帶果王”美譽的芒果（Mangifera indica L.）因其風味獨特、口感嫩滑、營養價值較高而深受消費者的喜愛。我國芒果種植主要分布在海南、廣西、云南、四川、貴州等省區。據統計，2018 年我國芒果總產量226.81 萬t，年產值超過100 億元[1]。

芒果炭疽病是由炭疽菌屬（Colletotrichum）真菌引起的，是芒果生產中發生面積最廣、危害最嚴重的病害之一。研究發現，采后芒果果實的蒂部、中部和端部均可能潛伏一定數量的炭疽菌，炭疽菌多數在芒果果實發育期間侵入，隨著采后果實抗性的降低和可利用營養物質的增加，病菌由潛伏狀態轉變為致病狀態，引起果實出現圓形或近圓形、褐色或黑色凹陷的病斑，病斑輕則呈點狀分布，重則連片發病，導致果實腐爛變質，喪失商品價值[2]。每年我國芒果采后損失高達20%～30%，而發達國家也達到15%左右[3]。

芒果采后炭疽病的防治以化學防治為主，生產者主要依賴甲基硫菌靈、多菌靈、苯醚甲環唑等合成殺菌劑控制芒果炭疽病。然而，合成殺菌劑處理過的芒果有農藥殘留且不易降解，易引發食品安全和環境問題，其中一些已被芒果國際貿易條約禁止[4]。生物防治因具有殘留低、毒性小、無公害等優點，逐漸得到廣泛應用[5]。生防菌是生物防治的有效手段之一，目前已經從植物和土壤中分離出許多具有拮抗作用的細菌、絲狀真菌和酵母菌，這些微生物對芒果采后炭疽菌具有明顯的抑制作用。本文對芒果采后炭疽病病原菌種類，主要生防菌的類別，病原菌的拮抗機制，以及如何增強生防菌的防治效果進行綜述，以期為我國芒果采后炭疽病新型農藥的制備與抗病資源的選育提供有價值的參考。

1 芒果炭疽病病原菌種類

20 世紀90 年代前，炭疽菌屬真菌的分類主要依賴于形態學方法[6-9]。形態學鑒定是Sutton 在von Arx分類研究的基礎上總結的一種傳統分類方式，以純培養條件下病原菌的菌落特征（顏色、質地和生長速率），分生孢子和附著孢的形態、大小，剛毛、菌核、厚垣孢子、有性型的有無及寄主范圍等方面進行分類。通過形態學分類方法，芒果采后炭疽病病原菌多被鑒定為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）[10-11]。由于炭疽菌屬真菌可用于分類的形態指標較少，且其菌落特征、孢子和附著孢的大小、形態仍存在不穩定性，不能很好地區分炭疽菌的種和亞種，表現出極大的局限性。而對基因型分型的分子生物學分類則有力避免了上述問題[12-13]。

1994 年，Sherriff 等[14]將核糖體轉錄間隔區（Internal transcribed spacer，ITS）序列分析引入了炭疽菌屬。截至2020 年7月，NCBI 中已經登錄了近23000 條Colletotrichum的ITS 序列，其中芒果上發現的炭疽菌ITS 序列有1200 余條。隨著該研究方法應用的深入，前人發現ITS 在種類較多、種間形態學差異較小的炭疽菌屬的研究中存在明顯局限性。2000 年，Taylor等[15]提出使用基于多基因譜系識別生物物種和系統學種概念。Crouch 等[13]將ITS 與鄰近DNA 裂解酶基因Apn2、交配型基因Mat1、氧化物歧化酶基因Sod2位點進行聯合分析，對復合群C.graminicola進行了有效區分，并在該屬中發現6 個新種。基于多基因分析方法，前人發現前述引起芒果炭疽病的兩大病原菌——C.gloeosporioides和C.acutatum，均為復合群，C.gloeosporioides可細分為31 個種1 個亞種[16-23]，而C. acutatum也包含了29 個種[24]。Lima 等[18]聯合肌動蛋白基因ACT、鈣調蛋白基因CAL、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因GAPDH、β-微管蛋白基因TUB2和ITS 序列對巴西東北部芒果炭疽病病原菌進行分析，發現了C. asianum、C. fructicola、C. tropicale、C. karstii，以及一個新種C.dianesei。2018 年以前，國內報道的芒果炭疽病病原菌主要為C.gloeosporioides，采用的鑒定手段主要是基于傳統形態學及ITS 序列。近兩年來，通過在傳統形態學的基礎上引入多基因位點分析的方法，在芒果主產區陸續發現多種芒果炭疽病致病菌。在廣西，發現C.asianum、C.siamense、C.fructicola、C.scovillei均能引起芒果炭疽病的發生，且前3 種病原菌為優勢種群[25]；在海南，對臺農芒果采后炭疽病的病原鑒定，發現其致病菌同廣西基本一致，只是未發現致病菌C.scovillei[26]；Li 等[27]對我國海南、云南、四川、貴州、廣東、福建等主要產區的芒果炭疽病進行分離，通過形態學觀察并聯合ACT、幾丁質合成酶I 基因CHS-I、GAPDH、TUB2，以及ITS 序列進行分析，在獲得的200 余份致病菌中共鑒定出13 種炭疽菌，除上述在我國發現的4 種炭疽菌外，其他9種炭疽菌均是我國芒果炭疽病原的首次報道。目前，國內外已報道的芒果炭疽病的病原菌有28 種，其中國內已報道的有14 種（表1）。

表1 國內外已報道的芒果炭疽菌種類、地理來源及其鑒定所選用的基因Table 1 Species,geographical sources and selected genes of mango anthracnose reported in domestic and abroad

2 芒果采后炭疽病生防菌種類

生防菌是對寄主無害而對病原菌有明顯抑制作用的微生物。用于果蔬采后病害的生防菌主要有細菌、酵母菌及絲狀真菌。生防細菌是目前商業化生防制劑中應用最廣泛的類別，與真核生防菌相比，其來源廣泛，繁殖迅速，但易受殺菌劑影響，且在果蔬加工過程中容易失活[45]。生防酵母菌一般通過營養、空間競爭發揮拮抗作用，易于定殖，防效譜廣且穩定，近年來已逐漸成為采后病害生物防治的研究熱點[46]。由于生防絲狀真菌在果蔬上較難定殖，因此絲狀真菌往往是通過人工培養后，利用其發酵液進行生物防治[47]。前人通過從不同植物的枝葉及生存的土壤中進行分離篩選，現已獲得了部分對芒果采后炭疽病具有一定生防作用的菌株。表2 為目前在芒果采后炭疽病防治中已發現的生防菌及其作用機制。

表2 芒果采后炭疽病生防菌種類及作用機制Table 2 Antagonistic species and mechanisms of mango postharvest anthracnose

2.1 生防細菌

細菌種類繁多，繁殖速度快，在植物和環境中廣泛存在，可人工培養，這些特性對細菌占領空間和生存競爭十分有利。因此，有關采后生防細菌的報道很多，而芒果炭疽菌生防細菌主要為芽孢桿菌Bacillusspp.。Balderas-Ruíz 等[54]報道了從墨西哥芒果樹上分離得到的貝萊斯芽孢桿菌83 能有效控制芒果炭疽病。汪遠等[48]從紅樹植物秋茄體內分離得到解淀粉芽孢桿菌，該菌株對芒果采后主要病害病原菌C.gloeosporioides具有較強抑制作用，對采后芒果炭疽病防效達到60%以上。謝穎等[55]從海南大羽蘚葉片中分離的綠芽孢桿菌對芒果炭疽病最大抑菌率達83%。此外，楊苑等[57]對抗生素溶桿菌進行拮抗試驗，抑制率達53.7%。趙超等[58]從芒果葉片與果實中分離篩選出C.gloeosporioides的生防菌，發現熒光假單胞菌對芒果采后炭疽病防效為80.05%，防效明顯。Hernandez Montiel 等[60]發現感染海洋細菌嗜根寡養單胞菌KM02的芒果的炭疽病發病率降低了89%，病斑直徑減小了92%。

2.2 生防酵母菌

在生防菌中，酵母是控制采后病害的潛力拮抗菌，具有拮抗效果好、抗逆性強、繁殖快速、不產生抗生素、安全性高等優點。許春青[61]發現，季也蒙畢赤酵母與炭疽菌對峙培養時抑菌帶明顯，該菌產生的揮發性物質對芒果炭疽菌的生長及其分生孢子的萌發有抑制作用，對采后芒果離體葉片的防效達75%。Tian等[62]研究了美極梅奇酵母對臺農芒果炭疽病的防治效果，發現在芒果傷口處接種酵母菌和病原菌，于25 ℃貯藏條件下培養12 d，抑制率達78.82%。Konsue等[71]研究發現，Papiliotrema aspenensisDMKU-SP67可以控制膠孢炭疽菌生長，將炭疽病的發病率降低了94.1%，與使用苯菌靈效果相當。此外，膜醭假絲酵母、漢遜德巴利酵母、東方伊薩酵母等酵母菌也被證明對芒果炭疽菌有拮抗作用[59-60,63]。

2.3 生防絲狀真菌

除細菌和酵母菌外，用于采后芒果炭疽病生物防治的生防菌還有絲狀真菌。絲狀真菌來源豐富，能夠代謝產生多種具有抗性的物質，利用其發酵液防治芒果病害的研究很多，在芒果炭疽病防治中起重要作用。張詒仙[69]報道了青霉屬（Penicillium）的瓦克青霉（T-141 株）、特異青霉（Penicillium notatum）和產黃青霉（Peniciuium chrysogenus）能通過產生青霉素而起到防治芒果炭疽病的作用。黃雪蓮等[67]發現，綠色木霉菌揮發性代謝產物及非揮發性代謝產物均有抑菌作用，對芒果炭疽菌的抑菌率達70%以上。De Los Santos-Villalobos 等[66]報道了棘孢木霉T8a 在體內外均能抑制膠孢炭疽菌，且該菌產生的纖維素酶比幾丁質酶和葡聚糖酶更具有生物防治作用。

3 生防菌防治機理

由于生防菌、病原菌和寄主三者均為活的有機體，因此三者相互接觸后，會發生復雜的的拮抗、誘抗作用。生防菌對病原菌抑制作用可分為兩種形式：一是直接作用；二是間接作用。具體防治機理如圖1所示。

3.1 直接作用

直接作用是生防菌通過自身或胞外分泌物抑制病原菌，包括營養或空間競爭、分泌拮抗物質、重寄生等。研究表明，生防菌在作用于芒果最初的24 h 內可迅速生長，這個時間段主要的作用方式是營養競爭和空間排斥。而生防菌分泌抑制或殺死芒果炭疽菌的代謝物是最常見的防治方式。拮抗物質主要包括抗生素、拮抗蛋白或細胞壁降解酶類。芽孢桿菌是最普遍的生防菌之一，該菌產生的拮抗物質包括脂肽類抗生素[53]、細菌素[49]、細胞壁降解酶及一些未鑒定的拮抗蛋白[48,73]，可以造成芒果炭疽病菌菌絲扭曲、膨大、畸形，從而抑制芒果炭疽病菌的生長。海洋放線菌發酵產物分離的化合物會破壞芒果炭疽病菌細胞膜的結構。巨大芽孢桿菌的抑菌機制是通過誘導炭疽菌孢子體內活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平及菌絲體內丙二醛（Malonic dialdehyde，MDA）含量，破壞其線粒體和細胞膜而達到抑菌效果[51]。低毒分枝病毒可能會下調與真菌致病力相關的基因表達（如銅胺氧化酶和Fe/S 蛋白）來減弱病原菌的致病性，并抑制其生長。此外，許春青[61]發現，季也蒙畢赤酵母能夠吸附到芒果炭疽菌菌絲上，可能存在重寄生作用。

3.2 間接作用

間接作用主要是生防菌通過自身或分泌代謝產物誘導植物產生抵御病原的酶或其他活性物質。美極梅奇酵母、枯草芽孢桿菌除了與膠孢炭疽菌爭奪碳源和生存空間、產生抑菌物質，還能促進植物相關防御酶的活性，如β-1，3-葡聚糖酶（β-1,3-gluca-nase，GLU）和幾丁質酶（CHT），它們能破壞芒果炭疽菌的細胞壁而達到防治作用[62,74]。任建國等[70]報道了鏈霉菌與芽孢桿菌能通過誘導芒果植株苯丙氨酸解氨酶（Phenylalllanine ammonialyase，PAL）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（Peroxidase，POD）的活性來提高芒果對炭疽菌的抗性。此外，熒光假單胞菌也能通過誘導芒果的抗性來阻止病原真菌的入侵[57]。

隨著高效生防菌的不斷挖掘及拮抗機理研究的深入，近年來已報道多種實現商業化的菌株。在南非，由枯草芽孢桿菌開發的生防制劑Avogreen 被用于鱷梨炭疽病的防治[75]。美國開發的生防制劑Blight Ban A506，以熒光假單胞菌作為拮抗菌，對蘋果、梨和草莓等水果的多種病害具有防治效力[76]。在荷蘭與德國，以梅奇酵母為主要成分的生防制劑Shemer 被廣泛應用于果蔬灰霉病和青霉病的防治[77]。

4 增強生防菌生防效力的途徑

生防菌在芒果采后炭疽病的控制中雖已表現出良好的防效，但活體拮抗菌是生防制劑主要成分，拮抗菌活性及其代謝的酶類易受溫度、pH 和濕度等環境因素的影響，導致其防治芒果采后炭疽病的效果不如化學農藥穩定。此外，與化學農藥相比，生防菌研發成本較高，生效慢，使用期限較短，不如化學農藥方便。因此，通過各種方式提高生防菌的生防效力和穩定性，將有助于提高生防制劑的商業化。研究表明，生防菌配合化學藥物，生防菌與熱處理結合，以及通過基因工程改造措施均能有效提高生防菌防治效力。

生防菌與外源化合物配合使用進一步提高生防效力，是目前芒果采后炭疽病防治的研究熱點。這些化合物主要包括低濃度殺菌劑、有機活性物質和無機鹽等。Govender 等[50]對咪鮮胺與生防菌聯合處理、生防菌單獨處理在芒果包裝線上防治芒果炭疽病的效果進行評價，發現聯合處理生防效力明顯高于單獨處理。此外，前人發現水楊酸、氯化鈣與生防菌配合使用效力提升顯著。低濃度水楊酸（SA）對拮抗菌和病原菌的生長影響不大，但對PPO、PAL、GLU 等相關防御酶活性有一定誘導作用，可以通過誘導植物的防御能力，增強生防效力[78]。馮衛華等[79]使用1.0 mmol/L 水楊酸與綠色木霉菌聯用，發現該組合對芒果炭疽病的防效明顯增強。氯化鈣是通過抑制病原菌的生長，并在一定程度上促進生防菌的增殖和芒果的自身防御力來提高生防效力。陳敏等[80]發現，40 g/L CaCl2可有效提升季也蒙畢赤酵母對芒果采后炭疽病的生防效果，其中40 g/L CaCl2與1×108CFU/mL 季也蒙畢赤酵母懸浮液的復合處理比單一處理更能有效抑制芒果果實采后炭疽病的發生。此外，水楊酸溶液、CaCl2溶液和美極梅奇酵母懸浮液的組合也具有協同作用，能提高對芒果果實病害的控制和貯藏效果[81]。

生防菌與熱處理結合能提高生防效力，該方法操作簡單、成本低，是芒果采后炭疽病防治最常用的方式之一。前人發現，在半商業條件下，咪鮮胺、芽孢桿菌與熱水聯合處理防治芒果炭疽病比化學制劑的效果更好[50]。Jomduang 等[63]報道了東方伊薩酵母與熱處理結合可以增強對芒果炭疽病的防效。此外，對生防菌進行遺傳改造是一個新的發展方向。Jones 等[82]將抗菌肽A 的編碼基因轉入釀酒酵母（Saccharomyces cerevisia），轉化酵母有效地抑制了刺盤孢的孢子萌發，并顯著減輕了由該菌引起的番茄炭疽病。然而，目前利用轉基因技術防治芒果采后炭疽病的研究較少，對芒果的防治效果有待進一步研究，且改造的菌株應用到實際生產中，必須經過后續的安全驗證。

5 總結與展望

近年來，人們已經從多種途徑中分離出芒果炭疽病生防菌，且其易培養，繁殖快，防效顯著，因此其作為生防制劑的研究價值日益受到關注。目前，生防菌抑菌效果易受環境影響，且控病機制還未完全揭示，因此生防菌的實際生產應用仍存在較大困難。生防菌與外源化合物聯用、生防菌配合物理保鮮方式以及生防菌進行遺傳改造是其應用到實際生產的重要途徑，這不僅可以加強拮抗菌的生防效力和穩定性，還可產生保鮮防腐的柵欄效應。雖然目前我國農業生產仍是化學制劑占主導地位，但隨著國際貿易條約的限制以及國家和人民對環境污染和食品安全的愈加重視，以拮抗菌為主的生防制劑必將迎來更快更深入的發展。