栽培草莓潛在印記基因FaTRG-31的克隆與特征分析

安 琪，張 紅，懷欣佳，荊曉彤，熊勁松，喬玉山

(南京農業大學 園藝學院， 南京 210095)

水通道蛋白(aquaporin，AQPs)是一類能通過在細胞膜上組成“孔道”并高效轉運水分子的內在蛋白。AQPs包括6個跨膜螺旋(TM1～TM6)、5個連接它們的環(A-E)[1]、2個高度保守的NPA(asparagine-proline-alanine)基序[2]、Ar/R(芳香/精氨酸)選擇性過濾器。AQP具有運輸水和其他底物的功能，通過NPA基序和Ar/R區域的氨基酸殘基幫助其進行底物的選擇，加強通道的特異性。植物水通道蛋白主要有5類：質膜內在蛋白(plasma intrinsic proteins, PIPs)、液泡膜內在蛋白(tonoplast intrinsic proteins, TIPs)、類NOD26膜內在蛋白(nodulin-26 like intrinsic proteins, NIPs)、小分子堿性膜內在蛋白(small basic intrinsic proteins, SIPs)和X內在蛋白(X intrinsic proteins, XIPs)[3]。

PIPs分為PIP1型和PIP2型。PIPs參與吸收和運輸水、尿素[4]、硼酸[5]和二氧化碳[6]等，其主要功能是通過調節植物細胞滲透勢來介導水分子的跨膜運輸，進而參與調節植物生長發育的諸多過程[2, 7-8]。研究表明，PIPs家族在蘋果、番茄、葡萄等多種植物中被發現與種子和果實發育有關[9-11]。此外，當植物抵御干旱、鹽和滲透脅迫時，植物細胞的PIPs通過發生表達水平、蛋白結構等不同的適應性改變，從而發揮重要作用[12-13]。草莓中水通道蛋白的相關報道較少，二倍體草莓中確定了10種AQP，屬于PIP和TIP亞家族[14]。栽培草莓中鑒定出9種AQP，分別是FaRB7、FaPIP1;1、FaPIP2;1、FaNIP1;1、FaPIP1;2、FaPIP1;3、FaPIP2;1(b)、FaPIP2;2和FaTIP(a)。研究表明，FaRB7啟動子可以誘導草莓根特異性表達[15]；FaPIP1;1表達模式與生長素和成熟過程密切相關[16]；FaPIP2;1基因編碼具有高透水性的水通道，其表達模式與果實硬度相關[17]；FaNIP1;1主要在果實中表達并具有與成熟相關的表達模式，受脫落酸正調節，生長素負調節[18]；FaPIP1;2各組織均有表達且差異不顯著，FaPIP1;3為葉特異性表達，FaPIP2;1(b)主要在地上營養組織中表達，FaPIP2;2在葉片和葉柄中的表達明顯高于果實組織，FaTIP(a)果實中的表達較高[19]。本課題組前期通過轉錄組測序發現的一個栽培草莓潛在的印記基因FaTRG-31(turgor-responsive protein 31)，研究表明TRG-31屬于質膜內在蛋白(PIPs)家族[20-21]。

Kermicle等于1970年發現，玉米中R基因的某些等位基因從一個親本遺傳時產生完全著色的籽粒，而從另一個親本遺傳時則不會產生[22]，首次在植物中發現印記基因。基因組印記(genomic imprinting)是指親本染色體上等位基因的表觀遺傳修飾差異而導致只有一個等位基因表達，另一個沉默或者表達量低的現象。具有這種父母本差異表達現象的基因被稱為印記基因。根據印記基因的親本來源不同可以分為兩種類型：母源印記基因(maternally expressed imprinted gene，MEGs)和父源印記基因(paternally expressed imprinted gene，PEGs)[23]。現已在真菌、哺乳動物和開花植物中鑒定出印記基因，開花植物中的印記基因主要在胚乳中表達，只有少數印記基因在胚中被報道[24]。隨著高通量技術的成熟和應用為印記基因的鑒定提供了更高效的方法。在擬南芥和水稻中通過系統的全基因組測序已鑒定出上百個印記基因[25-31]，但其中大多數尚未得到證實且沒有明確的功能。目前草莓中，通過傳統的實驗手段僅我們在森林草莓(FragariavescaL.)中鑒定出5個印記基因，分別是FvARI8、FvBRO1、FvKHDP-2、FvDRIP2和FvLTP3[32]，但仍缺乏對草莓印記基因表達模式及生物學功能的研究。FaTRG-31作為栽培草莓中潛在的印記基因，為明確該基因的印記類型及表達特征，本研究從栽培草莓‘紅顏’中克隆得到該基因，并對其表達模式、印記特性等進行初步分析，以了解該基因的作用機理進而為草莓印記基因表達調控機制及生物學功能的深入研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為八倍體栽培草莓‘紅顏’(B)和‘甜查理’(S)，種植于南京農業大學白馬教學基地。收集‘紅顏’草莓的根、短縮莖、葉、花萼、花瓣、花藥、花托、子房、花柱、12 DAP(days after pollination)的胚及胚乳、種皮，‘甜查理’草莓12 DAP的胚乳，B(♀)×S(♂)、S(♀)×B(♂) 12 DAP的胚乳，液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。試驗所用質粒為pCAMBIA1302-GFP，所用大腸桿菌菌株為DH5α，農桿菌菌株為EHA105，煙草為本氏煙草(NicotianabenthamianaDomin)。

1.2 方 法

1.2.1FaTRG-31的克隆與生物信息分析以‘紅顏’草莓12 DAP的胚乳為材料，總RNA提取參照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(Tiangen)說明書進行。凝膠電泳檢測完整性后利用PrimeScript Ⅱ1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)合成cDNA。在GDR數據庫(https://www.rosaceae.org/)中搜索maker-Fvb7-1-augustus-gene-257.46-mRNA-1獲得草莓FaTRG-31基因序列，利用DNAMAN設計擴增引物(表1)。以‘紅顏’12 DAP的胚乳cDNA為模板，按照2×Hieff Canace?Gold PCR Master Mix(翌圣)說明書進行PCR擴增。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳并回收目的條帶，連接pClone007 Blunt Simple(007BS)載體(擎科)，轉化大腸桿菌DH5α后挑選陽性克隆由公司完成測序。

利用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)、Conserved domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、Signal P5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)等在線網站對FaTRG-31進行蛋白質分子量、等電點、跨膜區、信號肽和亞細胞定位的預測。通過MEGA 7.0軟件分析FaTRG-31氨基酸序列與擬南芥和葡萄中的PIP不同亞型蛋白序列之間的親緣關系，采用Neighbor-Joining(NJ)法構建進化樹，用Bootstrap重復1000次進行校正，其他參數默認[33]。

1.2.2 FaTRG-31亞細胞定位分析以pCAMBIA1302-GFP植物表達載體為基礎，設計帶有酶切位點BglⅡ和SpeⅠ的載體引物(表1)對FaTRG-31編碼區進行擴增，構建植物表達載體pCAMBIA1302-GFP-FaTRG-31。將構建好的表達載體和pCAMBIA1302-GFP空載體質粒分別轉入農桿菌EHA105。參照Zheng等[34]的農桿菌介導法，將重懸后OD值為0.6左右的菌液注射到本氏煙草葉片。置于培養箱中培養2～3 d后在激光共聚焦顯微鏡下觀察煙草葉片中的熒光信號并拍照記錄。

1.2.3FaTRG-31的組織表達特性分析以‘紅顏’草莓不同組織(根、短縮莖、葉、花萼、花瓣、花藥、花托、子房、花柱、12 DAP的胚及胚乳、種皮)為材料提取RNA，并反轉錄為cDNA。根據FaTRG-31的編碼區序列設計qRT-PCR引物(表1)，草莓內參基因為EF1-α[25]。檢測‘紅顏’草莓不同組織中FaTRG-31的表達水平。采用SYBR premix EX TaqTMreagent試劑盒(TaKaRa)進行qRT-PCR反應。反應體系(20 μL)為：SYBRpremixExTaq混合液10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA 1.0 μL和ddH2O 8.0 μL。反應程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40次循環。基因相對表達量通過2-ΔΔCt法[35]計算，試驗進行3次生物學重復。

表1 引物序列及用途Table 1 Primers and their amplification

1.2.4FaTRG-31啟動子的克隆及序列分析根據在GDR數據庫中檢索到的FaTRG-31基因序列，向起始密碼子上游2 000 bp進行搜索，獲得該基因所對應的啟動子序列。根據啟動子序列設計擴增引物(表1)。通過CTAB法提取‘紅顏’草莓基因組DNA，以其為模板進行PCR擴增。將回收的片段連接至007BS載體并轉化大腸桿菌DH5α后進行陽性克隆鑒定與測序。使用在線軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[36]分析FaTRG-31啟動子中包含的順式作用元件。

1.2.5FaTRG-31印記鑒定提取B、B(♀)×S(♂)、S(♀)×B(♂) 12 DAP的胚乳總RNA，并反轉錄為cDNA。以‘甜查理’12 DAP的胚乳cDNA為模板，根據GDR數據庫中包含單核苷酸多態性(SNP)位點的基因片段設計特異性引物(表1)，在‘甜查理’中克隆該基因片段進行RT-PCR測序分析，結合之前克隆的‘紅顏’FaTRG-31基因，獲得可靠的SNP位點。利用該SNP位點區分親本的等位基因，再以‘紅顏’與‘甜查理’正反交12 DAP的胚乳cDNA為模板進行擴增。根據劉國慶等[37]的方法使用DNA測序峰圖的面積來獲得堿基變異的比例，利用Image J[38]軟件計算DNA測序峰圖面積以獲得SNP位點堿基的變異比例。驗證草莓胚乳中FaTRG-31的印記特性。

1.2.6FaTRG-31在非生物脅迫下的表達分析取12株生長于盆缽中長勢一致的‘紅顏’草莓正常澆水，經3 d的緩苗期后開始脅迫處理，4株置于4 ℃環境中模擬低溫脅迫；4株澆灌300 mmol·L-1甘露醇溶液模擬干旱脅迫處理；4株澆灌100 mmol·L-1NaCl溶液模擬鹽脅迫處理。分別于脅迫處理后0、12、24、48、72和96 h取不同處理的草莓葉片，液氮速凍，-80 ℃保存備用。以未經脅迫處理和脅迫處理后不同時間的‘紅顏’葉片cDNA為模板，通過qRT-PCR分析FaTRG-31在非生物脅迫下的表達模式。內參引物、特異引物、反應體系、程序及數據分析同1.2.3。

1.3 數據分析

數據分析用SPSS 22軟件進行，通過Duncan法進行顯著性分析(P<0.05)，用Excel 2017制圖。

2 結果與分析

2.1 FaTRG-31的克隆與生物信息分析

以‘紅顏’草莓12 DAP的胚乳cDNA為模板進行PCR擴增，獲得了大小約1 000 bp的單一條帶(圖1，A)，測序分析結果表明，該基因包含一個長為999 bp的完整開放閱讀框，編碼332個氨基酸。

ProtParam預測理化性質顯示，FaTRG-31編碼的蛋白質分子量約為33.6 kD，等電點為9.10，不穩定系數(instability index Ⅱ)為29.99，親水性平均數(GRAVY)為0.370，屬于穩定的疏水性蛋白。SignalP和TMHMM分析顯示，FaTRG-31不含信號肽，且具有AQPs家族典型的6個跨膜區(分別位于氨基酸序列第99～121、136～158、178～195、224～241、254～276、302～324位)，是一類膜蛋白。WoLF PSORT預測結果顯示，FaTRG-31定位在細胞質膜中。在線軟件(https://prosite.expasy.org/)分析FaTRG-31的氨基酸序列，其中含有AQPs家族兩個高度保守的NPA基序和SGGHINPAVT序列。此外，還含有水通道蛋白家族PIPs亞家族的高度保守序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VIVF/YN(圖2)，說明FaTRG-31屬于質膜內在蛋白(PIPs)家族。

將FaTRG-31蛋白序列與擬南芥和葡萄的PIP蛋白序列進行比對，利用MEGA7.0軟件構建系統發育樹(圖3)發現，FaTRG-31與所有PIP1型質膜水通道蛋白的氨基酸相似性均高于90%，并與FaPIP1;1親緣關系最近，相似性超過98%。

2.2 FaTRG-31的亞細胞定位

為確定FaTRG-31亞細胞定位情況，將FaTRG-31構建到pCAMBIA1302-GFP植物表達載體中，成功構建pCAMBIA1302-GFP-FaTRG-31融合表達載體，待質粒成功轉化農桿菌EHA105后注射煙草葉片背面，并以空載為對照，利用激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的表達情況。結果(圖4)顯示，在空載對照中熒光信號在細胞質、細胞核和細胞膜等部位都能觀察到，而pCAMBIA1302-GFP-FaTRG-31融合蛋白只在細胞質膜上觀察到熒光信號，說明FaTRG-31蛋白定位于細胞質膜上。這與亞細胞定位預測結果一致，且與PIPs家族其他成員定位結果一致[39]。由此得出FaTRG-31屬于質膜內在蛋白(PIPs)家族。

2.3 FaTRG-31在不同組織中的表達模式

為明確FaTRG-31的表達特點，對草莓的根、短縮莖、葉、花萼、花瓣、花藥、花托、子房、花柱、12 DAP的胚及胚乳、種皮等不同組織進行qRT-PCR分析。結果顯示：FaTRG-31基因在‘紅顏’草莓的不同組織中均有表達，在胚乳中的表達量最高，其次是花萼、短縮莖和花柱，子房最低(圖5)。

2.4 FaTRG-31啟動子作用元件分析

為了驗證FaTRG-31啟動子中是否存在胚乳表達相關的作用元件，以‘紅顏’草莓的基因組DNA為模板，擴增出FaTRG-31起始密碼子上游1 989 bp的啟動子序列(圖1，B)。通過Plant CARE在線網站對FaTRG-31啟動子進行分析。結果顯示，FaTRG-31啟動子區除了含有啟動子結合位點相關元件(TATA-box、CAAT-box)外，還有與胚乳表達相關的作用元件(GCN4-motif)，以及4種光響應元件(GT1-motif、Box4、G-box、TCT-motif)、2種激素響應元件(ABRE、TGA-element)、3種與干旱和鹽等脅迫相關的響應元件(TC-rich repeats、MBS、MYC)(表2)，這可以部分解釋該基因在胚乳中高表達的原因。

2.5 FaTRG-31印記鑒定

根據FaTRG-31基因在胚乳組織中高表達，植物中的印記基因同樣也主要在胚乳中表達。為明確栽培草莓潛在印記基因FaTRG-31的印記特性，以‘紅顏’、‘紅顏’(♀)ב甜查理’(♂)、‘甜查理’(♀)ב紅顏’(♂)正反交12 DAP的胚乳cDNA為模板，對預測含有SNP位點的基因片段進行擴增。結果顯示(圖6)，兩親本的FaTRG-31基因序列在570 bp處存在SNP位點。在‘紅顏’做母本的雜交胚乳中，該SNP位點與親本‘紅顏’相同；而在‘甜查理’做母本的雜交胚乳中，該SNP位點與‘甜查理’相同。以上結果表明在此SNP位點處胚乳中等位基因的表達只和母本有關，即只表達母本的等位基因，不表達父本的等位基因，說明該基因是母源印記基因(MEG)。

2.6 FaTRG-31在不同脅迫處理下的表達分析

鑒于FaTRG-31啟動子序列上含有多種與非生物脅迫相關的響應元件(MBS、TC-rich repeats)，同時PIPs類基因多與抗逆性相關。為進一步研究FaTRG-31的功能特性，分別采用低溫、干旱和鹽脅迫處理‘紅顏’草莓，通過qRT-PCR方法檢測脅迫處理后草莓中FaTRG-31的表達水平。結果顯示(圖7)，在4 ℃低溫處理下，FaTRG-31的表達水平呈現先下降后上升的趨勢，在48 h時出現最低值，然后逐漸升高，表明較長時間的低溫條件上調該基因的表達。在干旱處理后，FaTRG-31在脅迫后12 h里小幅度上調表達，12 ～ 48 h內顯著下調并低于對照水平，而后又在72 h時上調至12 h時的水平，表明干旱短時間上調該基因的表達。在鹽脅迫處理后，FaTRG-31與干旱處理后表達模式類似。在前期小幅上調表達，之后轉錄水平迅速下調至低于對照，而后逐漸上調，在72 h時達到最高，復又下調至對照水平，表明鹽脅迫下FaTRG-31也有較高水平的表達。通過了解FaTRG-31在低溫、干旱及鹽脅迫下的表達模式，推測該基因可能在草莓抵御低溫和滲透脅迫過程中起作用。

3 討 論

目前植物中已發現許多印記基因[24]，但關于草莓印記基因的研究還比較少。本研究從‘紅顏’中克隆得到栽培草莓潛在印記基因FaTRG-31，通過生物信息學、系統進化樹分析發現FaTRG-31編碼的蛋白質屬于典型的水通道蛋白(AQPs)家族中質膜內在蛋白(PIPs)亞家族[2, 40]。此外，FaTRG-31蛋白的亞細胞定位于細胞質膜，此結果與預測結果及前人研究相一致[41-42]，這進一步證實了FaTRG-31屬于質膜內在蛋白家族。質膜內在蛋白(PIPs)家族中的不同成員表達模式不同[43]，有的組成型表達，如CsPIP1;2、CsPIP2;4和CsPIP1;3在子房、果實和花中高表達[44]；有的特異性表達，如PePIP2;7在葉中特異性表達，且主要在成熟葉片的葉肉細胞中表達[45]。本研究通過對FaTRG-31在‘紅顏’各組織中的表達分析發現FaTRG-31在胚乳中高表達。植物體內基因表達受到嚴格調控，涉及到啟動子、終止子等調控元件，其中啟動子序列具有主導作用[46]。本研究進一步從‘紅顏’草莓中克隆到了FaTRG-31基因上游1 989 bp左右的啟動子序列，序列分析表明啟動子上含有與胚乳特異性表達相關的作用元件(GCN4-motif)，這與FaTRG-31基因在胚乳中高表達相吻合，表明其可能在胚乳中發揮作用。研究表明，被子植物中的印記基因主要發生在胚乳，玉米[47]、擬南芥[48]中的印記基因均在胚乳中高表達，并且在種子早期發育過程中也有表達[49-50]。此外，印記基因還參與細胞分裂[27]、營養轉移[51]、胚乳發育[52]和種子大小的調控[53]等生物學過程。FaTRG-31是前期通過轉錄組測序在栽培草莓中篩選出來的潛在印記基因，本研究在親本中篩選出可靠的SNP位點，通過單等位基因表達進行印記驗證。研究結果顯示，草莓雜交胚乳中經驗證的SNP位點處只表達母本的等位基因，不表達父本的等位基因，結合組織表達分析顯示該基因在胚乳中高表達，說明FaTRG-31為印記基因且是母源印記基因(MEG)。對于該印記基因的具體功能和調節機制等一系列問題還需進一步研究。

高等植物基因的表達主要由啟動子與轉錄因子的相互作用來調控，啟動子的調控元件決定了基因的特定表達，其作用元件可以反映相應基因的功能[54]。除了與胚乳表達相關的響應元件，啟動子中還有與干旱和鹽脅迫相關的響應元件(TC-rich repeats、MBS、MYC)。印記基因FaTRG-31屬于PIPs家族，研究表明多數PIPs家族基因在植物抗逆分子機制中參與應答反應[55-56]。TaAQP7和TaAQP8在煙草中的過表達分別導致對干旱和鹽脅迫的抗性提高[55,57]；過表達PIP1;2基因的香蕉植物表現出對干旱、鹽分和寒冷脅迫的抵抗力增強[58]；香蕉MaPIP1;1在擬南芥中的異源過表達通過減少膜損傷、改善離子分布和維持滲透平衡來增加對鹽和干旱脅迫的耐受性[59]。草莓中也有相關研究表明，RdreB1BI通過激活草莓中的AQP相關基因來增強抗旱性[60]。本研究通過實時熒光定量PCR探究了非生物脅迫處理下印記基因FaTRG-31的表達模式。結果顯示，低溫脅迫下該基因表達模式表現為短時間下調而后逐漸上調；干旱脅迫下的基因表達模式和鹽脅迫下基因表達模式相似，均表現為前期小幅度上調而后下降復又上調表達。總體來看，長期低溫和早期的滲透脅迫時均上調表達，這與大麥葉片在脅迫下HvPIP1;6轉錄水平的增加表現一致[61]。此外，有研究表明擬南芥胚乳印記基因SDC會在非生物脅迫處理下被激活表達[62]。這暗示印記基因可能參與了植物對低溫、干旱和鹽等非生物脅迫的響應。通過了解FaTRG-31在非生物脅迫下的表達模式，推測該基因可能在草莓抵御低溫和滲透脅迫過程中起作用，這仍需進一步通過轉基因手段進行驗證。