西葫蘆CCD基因家族鑒定及其在果實發育中的表達

陳敏氡，王 彬，李永平，劉建汀，裘波音，朱海生

(福建省農業科學院 作物研究所，福建省蔬菜遺傳育種重點實驗室，福州 350013)

類胡蘿卜素是一類廣泛存在于生物界中的重要色素總稱。在高等植物中，類胡蘿卜素通過類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenase, CCD)裂解生成的脫輔基類胡蘿卜素及其衍生物，在影響農作物香氣，調控植株生長發育，參與植物激素ABA形成等方面具有重要調控作用[1]。CCD是一類非血紅素鐵酶，含有保守結構域RPE65(視網膜色素上皮特異性蛋白65，retinal pigment epithelial membrane protein)[2]。依據底物是否含有環氧結構，可將其分為類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(CCDs)和9-順式環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCEDs)[3-4]。

目前，在植物中發現的CCD家族成員共有12個，包括5個CCD亞家族(CCD1、CCD2、CCD4、CCD7和CCD8)和7個NCED亞家族(NCED1、NCED2、NCED3、NCED4、NCED5、NCED6和NCED9)。不同CCD家族成員在植物中發揮的作用各不相同[5]。CCD1基因能夠裂解β-隱黃質、玉米黃質、紫黃質等類胡蘿卜素9′-10′位置的雙鍵，形成紫羅蘭酮、香葉基丙酮和假紫羅蘭酮等芳香類物質，對植物香氣的形成具有重要調控作用[6]。研究發現，CCD1是控制杏[7]、煙草[8]等香氣物質形成的關鍵基因。CCD2是在藏紅花屬(CrocMs)植物中新發現的一個CCD家族基因，主要參與花香和花色物質(如藏花酸)的形成[9]。研究顯示，藏紅花CCD2基因的過表達會使其花被片、柱頭呈現黃色、橙色以及紅色[10]。近年來有研究顯示，在梔子的轉錄組數據中并未發現CCD2基因，推測梔子中參與藏花素合成的CCD基因可能不是CCD2基因，而是CCD4基因[11]。CCD4也在植物著色以及香氣物質的合成過程中發揮重要作用[12]。在金銀花[13]、百合[14]等植物中，CCD4是控制花器官呈現黃色或白色的關鍵基因。在西葫蘆中CCD4被發現參與果實著色調控[15]。CCD7 和CCD8 主要參與植物激素獨角金內酯的調控[16-17]。研究發現，CCD7和CCD8的表達差異會影響獨腳金內酯的合成，進而影響植物的發育。在土豆[18]、番茄[19]和水稻[20]等多種植物中，CCD7或CCD8被證實參與調控植物衰老、根的生長、分蘗以及花器官的發育等多種生命過程。NCED是植物脫落酸(abscisic acid, ABA)合成的限速酶，對植物抗逆性具有重要作用[21]。過量表達NCED基因不僅可以增加內源ABA的積累，還可以提高植株的干旱忍耐力[22]，此外，NCED還對植株的形態特征和光合作用產生影響[23]。

西葫蘆為葫蘆科(Cucurbitaceae)南瓜屬一年蔓生草本植物，是中國冬春季節設施栽培重要的瓜類蔬菜之一。迄今，西葫蘆中已克隆到了2個CCD基因，均為NCED亞家族基因。研究發現，這2個基因分別參與西葫蘆的果實發育過程，且受干旱誘導后顯著高表達，表明CCD基因在西葫蘆的生長發育及應對逆境脅迫過程起著調節作用。目前對西葫蘆CCD基因家族未見系統的報道，尤其是CCD亞家族基因。本研究基于已公布的西葫蘆全基因組數據，對西葫蘆CCD基因家族成員進行鑒定，并對該家族成員的理化性質、染色體定位、基因結構、保守基序、系統進化、順式元件以及共線性等進行分析，繼而研究CCD基因在西葫蘆不同組織及果實發育過程中的表達模式，為后續解析CCD基因家族在西葫蘆中的功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗以西葫蘆品種‘401’為材料，于2021年6月在福建省農業科學院作物研究所東張基地，分別采集子房授粉后3、5、7和20 d的西葫蘆果實，選擇無病蟲害、無機械損傷、大小一致、果形均勻的果實，每個樣品3個重復。采后將所有樣品液氮速凍，置于-80 ℃保存備用。

1.2 西葫蘆CCD基因家族的鑒定

參照已報道的9個擬南芥CCD蛋白序列，對西葫蘆的蛋白序列進行本地Blast，得到候選的西葫蘆CCD蛋白序列，接著提交到在線軟件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和在線工具CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)進行蛋白結構預測，刪除不包含RPE65結構域的序列，最終得到西葫蘆CCD家族基因。依據擬南芥中同源基因進行命名，將沒有同源基因的命名為CpCCD-like，同一個亞家族內的基因根據染色體上的位置按照小寫字母依次排序。西葫蘆全基因組數據、蛋白序列和注釋文件從CuGenDB數據庫(http://cucurbitgenomics.org/)中下載, 擬南芥CCD基因序列和蛋白序列從NCBI中下載。

1.3 西葫蘆CCD基因家族的生物信息學分析

利用ExPASy(https://www.expasy.org/)和在線工具SMS (http://www.bio-soft.net/sms/index.html)分析西葫蘆CCD蛋白的理化性質。利用在線工具CDD分析CCD基因中RPE65結構域的位置。利用WoLF PSORT (http://wolfpsort.org)預測亞細胞定位情況。利用TBtools軟件工具制作西葫蘆CCD基因家族的染色體定位圖。利用在線軟件MEME(http://meme-suite.org/)分析CCD蛋白序列的保守基序(Motif)。利用在線軟件GSDS(http://gsds. cbi.pku.edu.cn/)制作基因結構圖。利用MEGA 7.0軟件構建西葫蘆、擬南芥和番茄CCD蛋白系統進化樹，并使用在線工具Evolview(https://www.evolgenius.info/evolview/)對進化樹進行美化和可視化。利用Plant CARE 數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)分析順式作用元件的種類、數目及功能。利用MCScanX軟件檢測西葫蘆基因復制事件，并使用TBtools軟件進行西葫蘆CCD家族成員的共線性分析。

1.4 CCD基因家族的表達分析

1.4.1CCD基因在西葫蘆不同組織的表達分析利用實驗室前期已有的西葫蘆不同組織(根、莖、葉、花和果實)高通量轉錄組數據，收集所有CCD家族基因在不同組織中的FPKM值，對轉錄組數據進行標準化處理，并利用TBtools軟件繪制CCD基因家族成員在西葫蘆不同組織中的表達熱圖。

1.4.2CCD基因在西葫蘆不同果實發育時期的qRT-PCR分析采用通用植物總RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)提取西葫蘆不同發育時期(子房、授粉后3、5、7和20 d)果實總RNA, 將其作為模板，利用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)反轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)合成cDNA。利用Primer Premier 5軟件設計定量引物，具體引物序列見表1，其中西葫蘆EF-1a為內參基因。利用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)進行qRT-PCR分析，PCR反應體系為 cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，正、反向引物各0.8 μL和ddH2O 6 μL。擴增程序為95 ℃預變性30 s; 95 ℃變性5 s, 60 ℃退火34 s, 40個循環。每個處理3個重復, 并使用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量，用Excel軟件對數據進行作圖。

表1 本研究所用實時熒光定量PCR引物Table 1 qRT-PCR primers used in this study

2 結果與分析

2.1 西葫蘆CCD基因家族的鑒定與序列分析

從西葫蘆基因組中共鑒定出13個CCD基因并進行命名，13個西葫蘆CCD基因分布在9條染色體上，且分布不均勻，其中1號、12號、14 號染色體上分布較多(圖1)。序列分析表明，13個西葫蘆CCD基因編碼的氨基酸數目介于420～590，分子量介于47.29～65.89 kDa，等電點介于5.67～8.44。13個CCD基因的RPE65結構域位置各不相同(表2)。亞細胞定位結果顯示，西葫蘆CCD基因家族成員均定位于葉綠體或細胞質(表2)。

表2 西葫蘆基因組中鑒定到的CCD基因Table 2 The CCD genes identified in zucchini genome

2.2 西葫蘆CCD基因家族的系統進化分析

選取9個擬南芥(Arabidopsisthaliana) CCD蛋白，10個番茄(Solanumlycopersicum)CCD蛋白和13個西葫蘆CCD蛋白構建系統進化樹(圖2)，發現32個CCD 蛋白可分為 6個亞家族，分別為CCD1、CCD4、CCD7、CCD8、NCED、CCD1-like。CCD1、CCD4、CCD1_like和NCED亞家族之間具有更近的遺傳距離，而與CCD8和CCD7亞家族的遺傳距離較遠。CCD家族蛋白具有較高的保守性，推測它們可能具有相似或相同的基因功能。

2.3 西葫蘆CCD基因家族的保守基序(Motif)和基因結構分析

使用MEME工具在西葫蘆CCD家族蛋白中找到了10個Motif(圖3)。NCED亞組含有的Motif數量最多，為9～10個且種類基本相同；CCD各亞組間和組內所含Motif的種類與數量差異較大，其中CCD1和CCD4亞組含有的Motif數量最多，為7～9個，而CCD1-like和CCD7含有Motif數量最少，為3～4個。進一步分析西葫蘆CCD家族各成員的基因結構(圖4)發現，西葫蘆CCD基因家族外顯子數目為1～13個，內含子數目為0～12個；成員間結構存在較大的差異，其中CCD4和NCED亞家族基因結構較簡單，而CCD1和CCD1-like亞家族基因的結構復雜。

2.4 西葫蘆CCD基因家族的共線性分析

為進一步探索西葫蘆CCD家族基因的進化過程，本研究分析了CCD家族不同基因間的共線性關系，共發現5對CCD基因存在共線性關系(圖5)，分別為CpCCD4b和CpCCD4a、CpCCD8a和CpCCD8b、CpNCED3a和CpNCED3b、CpNCED5a和CpNCED5b、CpNCED5a和CpNCED9。這5對共線性的基因對中包括了4對同源基因，每對同源基因對分布在不同的染色體上，說明該家族在進化過程中發生了染色體片段復制事件。

2.5 西葫蘆CCD基因家族啟動子順式作用元件分析

進一步分析了西葫蘆CCD基因家族的啟動子區域(圖6)。結果表明，CCD基因家族的每個成員都含有大量的光信號響應元件，如G-box、GT1-Motif、TCT-Motif等，表明西葫蘆CCD家族基因具有光誘導的特性。大多數CCD家族成員含有激素以及環境脅迫響應元件，如生長素響應元件(TGA、TGA-box)、脫落酸響應元件(ABRE)、赤霉素響應元件(GARE-Motif、P-box、TATC-box)、茉莉酸甲酯響應元件(CGTCA-Motif、TGACG-Motif)、水楊酸響應元件(TCA)、干旱響應元件(MBS)、低溫響應元件(LTR)、防御脅迫響應元件(TC-rich repeats)和抗氧化響應元件(ARE)，推測西葫蘆CCD家族基因可能參與響應激素調控及抵御干旱、低溫等脅迫過程。除此之外，還發現少部分CCD基因含有響應生長發育相關元件，如調控晝夜節律響應元件(Circadian)、調控胚乳響應元件(GCN4-Motif)以及調控種子萌發響應元件(RY)，暗示CCD基因也參與植物的生長發育過程。

2.6 西葫蘆CCD基因家族的組織表達特性分析

根據前期獲得的西葫蘆不同組織的轉錄組數據，CCD家族成員在西葫蘆根、莖、葉、花和果實等5個組織中的表達見圖7。以FPKM值>1作為基因表達的篩選標準，發現其中3個基因(CpCCD8b、CpNCED5a和CpNCED6)在所有組織中的FPKM數值均小于1，可以認為它們在組織中不表達。余下的10個基因中，CpCCD1、CpCCD4a、CpCCD4b和CpCCD8a4個基因在所有組織中均有表達且表達量高，其中CpCCD1基因在葉和果實中顯著高表達(FPKM值>100)，提示該基因可能參與調控葉和果實的發育調控；其他6個基因表達量低，且部分基因在一些組織中不表達，其中CpCCD7和CpNCED9分別只在根和花中特異表達。

2.7 西葫蘆CCD家族基因在不同發育時期果實中的qRT-PCR分析

進一步分析了10個CCD基因 (CpCCD1、CpCCD4a、CpCCD4b、CpCCD8a、CpCCD1-like、CpNCED3b、CpNCED3a、CpNCED5a、CpNCED9和CpCCD7)在西葫蘆果實不同發育時期(子房以及授粉后3、5、7和20 d)的表達規律(圖8)。結果顯示，8個CCD基因(CpCCD1、CpCCD4a、CpCCD4b、CpCCD8a、CpNCED3b、CpNCED3a、CpNCED5a和CpCCD7)在果實發育過程中呈現上調表達，2個CCD基因(CpCCD1-like和CpNCED9)在果實發育過程中呈現下調表達，其中CpCCD1、CpCCD4a、CpCCD4b、CpCCD8a這4個CCD基因在果實膨大生長期或成熟期出現顯著高表達。CpCCD8a基因在授粉后3 d表達量顯著升高(P<0.05)，之后一直維持高表達，到授粉20 d果實中的表達量再次顯著升高(P<0.05)；CpCCD4a在授粉后5 和7 d表達量出現顯著升高(P<0.05)，之后在20 d再次顯著升高至最大值；CpCCD4b和CpCCD1在授粉后前5 d表達量較低，到授粉后7 和20 d表達量分別出現兩次顯著升高(P<0.05)，推測它們可能在西葫蘆果實生長發育過程中具有重要的調控作用。

3 討 論

CCD基因在高等植物中數量不一。擬南芥基因組中有9個CCD基因[3]，金銀花中有7個CCD基因[13]，煙草中有19個CCD基因[24]。本研究從西葫蘆基因組中獲得了13個CCD基因。研究發現不同物種間CCD成員數量差異主要表現在CCD4亞家族上，張亞飛等[25]認為這是該基因在進化過程中發生了基因擴增事件。除此之外，由于CCD4與植物果肉、花器官的著色密切相關，因此，顏色豐富的作物通常含有的CCD4成員也多。西葫蘆種質顏色多樣，有黃色、綠色和白色等。本研究在西葫蘆果實中鑒定到了2個CCD4基因，也印證了這個現象。在13個西葫蘆CCD基因中共發現4個基因對，占家族成員總數的60%以上，與張亞飛[25]、徐胤[26]等在柑橘、毛竹中的研究結果類似，提示CCD基因家族在進化過程中可能發生大量的復制現象，導致基因數量的擴增。共線性結果顯示這4個基因對均存在著共線性關系，而且單個基因還對應多個基因，推測它們可能具有相似或相同的基因功能。本研究對擬南芥、番茄和西葫蘆共 32個CCD蛋白的系統進化樹分析表明，CCD家族蛋白可分為CCD1、CCD4、CCD7、CCD8、NCED、CCD1-like 6個亞組，其中CCD1、CCD4、CCD1-like 和NCED亞家族之間的遺傳距離更近，表明它們彼此間的親緣關系更近。一般而言，同一基因家族親緣關系較近的基因，它們的基因結構也相似[27-28]。本研究中，西葫蘆CCD4和NCED亞家族內的基因結構相近且較簡單，除CpNCED9和CpCCD4a含1個內含子外，其他成員均不含內含子，這與柑橘CCD4和NCED亞家族基因的結構特點一致[25]。

本研究根據西葫蘆不同組織的轉錄組數據，分析了CCD家族成員的組織表達模式，結果顯示CCD家族成員具有組織表達特異性，這與束紅梅等[29]在西紅花上研究結果一致。其中CpCCD1基因在葉和果實中顯著高表達(FPKM值>100)，提示該基因可能參與調控葉和果實的發育調控。進一步分析了10個CCD基因在西葫蘆果實不同發育時期的表達規律，結果顯示，在果實發育過程中，8個CCD基因呈現上調表達，2個CCD基因呈現下調表達，其中CpCCD1、CpCCD4a、CpCCD4b、CpCCD8a這4個CCD基因在果實膨大生長期或成熟期出現顯著高表達，由此推測這4個CCD基因可能在西葫蘆果實發育過程中發揮調控作用。目前，已有文獻證實CCD4基因參與了西葫蘆果實發育過程中類胡蘿卜素的調控。Gonzalez-verdejo等[30]發現CpCCD4基因成員是調節西葫蘆果實中類胡蘿卜素含量的最重要基因，它們在果實類胡蘿卜素含量的降解過程中起重要作用。CCD1基因也在多種作物中被發現與果實發育密切相關。張印等[31]發現CCD1基因抑制表達后，柑橘果實中紫黃質、9-順式-紫黃質的含量顯著增加。劉盛雨等[7]研究顯示PaCCD1是控制杏果實脫輔基類胡蘿卜素類香氣物質形成的關鍵基因。梁乘榜等[8]發現CCD1基因參與了枇杷果實著色的調節。CCD8在植物果實發育方面的研究相對較少，它的主要功能是參與獨角金內酯的合成。獨腳金內酯是一種新型的植物激素，在調節植物分枝生長、根系發育及根瘤菌形成中發揮重要作用。由于獨腳金內酯可以誘導危害較大的列當屬種子萌發，因此，在番茄[32]、馬鈴薯[18]中會利用沉默CCD8基因表達，阻止獨腳金內酯的合成，從而降低列當種子的萌發率。本研究中，CpCCD8a在授粉后3 d一直處于高表達，說明它們在西葫蘆果實發育的中后期產生作用，而具體的作用機制仍需探究。最近，遼寧石油化工大學有項研究顯示，在手捻葫蘆雌花形成后定期噴施1.8 ～5.5 μmol/L的獨腳金內酯于雌花基部以及完成授粉后的果實部位，可以調節果實木質化進程，使手捻葫蘆上下部木質化時間分離，從而有利于優化果實形狀提高品質。因此，在今后研究中可以探索西葫蘆中是否含有獨腳金內酯，且CpCCD8a是否參與獨腳金內酯的合成，以及它與果實木質化的關系。

綜上，本研究提供了西葫蘆CCD基因家族的完整信息，并明確了CCD家族基因在西葫蘆不同組織及果實發育過程中的表達模式，為后續解析CCD基因家族在西葫蘆中的功能奠定了基礎。