UPLC-QTOF-MS法直接檢測碳酸飲料和茶飲料中8 種甜味劑

楊志敏，陳 源，劉淑坡，李 飛，李四中

（1.華僑大學a.分析測試中心；b.土木工程學院；c.材料科學與工程學院，福建廈門 361021；2.譜優科技（福州）有限公司，福州 350009）

0 引言

甜味劑作為一種無能量的蔗糖替代品，它的甜度可能是蔗糖的1.3 萬倍，廣泛應用于食品和飲料當中［1］。據估計，全球28%的人每天都食用甜味劑［2］。傳統的甜味劑有甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜和三氯蔗糖等，近年來又出現紐甜、甜菊糖苷等新型甜味劑。隨著甜味劑種類不斷增加以及應用領域的逐漸拓寬，其存在的問題也日益彰顯［3］。一些研究表明，大量食用甜味劑可能會對人類產生不良影響，如代謝紊亂、腎功能紊亂，甚至引發癌癥等疾?。?］。又因為甜味劑大多以復配形式添加，因此，建立一種同時檢測食品中多種甜味劑的方法至關重要。

甜味劑的檢測方法較多，主要有氣相色譜法［5-6］、高效液相色譜法［7-8］、液相色譜串聯質譜法［9-11］。這些傳統方法往往不能很好地分離多種甜味劑，而且檢出限較高，前處理過程復雜，容易受基質干擾出現假陽性的結果［12］。超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀（UPLC-QTOF-MS）結合了超高效液相的高分離能力和四極桿飛行時間質譜的高分辨功能，它不僅可以提供母離子精確分子質量，還可以提供大量多級碎片離子及其精確分子質量信息［13］，憑借其高通量、高分辨率、譜庫檢索、不依靠標準品也可分析等能力［14］，成為食品安全、藥物分析等領域重要分析手段。

本研究選取安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、三氯蔗糖和甜菊糖苷8 種甜味劑作為研究對象，采取直接過濾進樣的方式，建立了基于UPLCQTOF-MS檢測市售10 種碳酸飲料和茶飲料中8 種甜味劑的分析方法，并以實際樣品為代表，對這一新方法進行了考察，還就UPLC-QTOF-MS 不依靠標準品就能定性的特點對其他10 種文獻中報道過的甜味劑進行定性分析，為食品安全監測提供了新方法和技術支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色譜儀（美國Agilent公司產品），二元泵（G7120A）、自動進樣裝置（G7167B）、柱溫箱（G7116B）；Agilent 6545 飛行時間質譜儀（美國Agilent 公司產品），配有Mass Hunter Data Acquisition 實時采集工作站（Version B.06.01 Build 6.01.6172 SP1），Qualitative Analysis離線分析軟件（Version B.07.00 Service Pack2）。Milli-Q超純水機（美國Millipore公司產品）。

甲醇、乙腈（色譜純）為德國Merck 公司產品；醋酸銨（色譜純）為美國阿拉丁公司產品。安賽蜜（純度99.8%）為美國CATO 公司產品；甜蜜素（純度99.9%）、糖精鈉（純度85.68%）、阿斯巴甜（純度94.49%）為德國Dr.Ehrenstorfer 公司產品；阿力甜（純度99.4%）、鈕甜（純度95.2%）、甜菊糖苷（純度90.4%）為北京曼哈格BePure公司產品；三氯蔗糖（純度99.6%）為北京壇墨公司產品。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）；進樣體積5 μL；流動相：A為超純水溶液，B為甲醇溶液，梯度洗脫程序0～7 min，5%B升到50%B；7.01～9.00 min，70%B；9.01～12 min，100% B 流速0.4 mL／min；柱溫不控溫；平衡時間3 min。

1.2.2 質譜條件

采用鞘流雙電噴霧電離源，電噴霧離子源干燥氣采用高純氮，干燥氣溫度和流速分別設定為300 ℃和10 L／min，霧化氣壓力0.2 MPa，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速10 L／min，碎裂電壓130 V，毛細管電壓4 kV。一級質譜離子掃描范圍m／z100～1 100，掃描頻率1 張／s譜圖；二級質譜離子掃描范圍m／z50～1 100，掃描頻率2 張／s譜圖，碰撞能量設為10～40 eV，延遲時間設置為1 min。

選擇負離子模式下采集數據，參比離子質荷比（m／z）為1 033.988 1，每天采集數據前先使用調諧液（含125 μmol／L 三氟乙酸銨、5 μmol／L 嘌呤和1.25 μmol／L六甲氧基磷腈溶液，溶劑為乙腈∶水＝95∶5）進行質量軸的校準。

1.3 樣品前處理

取50 mL樣品，使用超純水進行適當稀釋，最后經過0.22 μm尼龍濾膜過濾。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相的選擇

流動相選擇中，首先考慮了甲醇與乙腈作為有機相，發現采用同一個洗脫梯度，當乙腈作為有機相時，雖然化合物保留時間普遍提前，但是安賽蜜、甜蜜素和糖精鈉的峰形較寬且分離度較差，此結果與文獻［15］一致。因此選擇甲醇作為有機相。

然后考察了以純水以及水相中添加2 mmol／L 醋酸銨，5 mmol／L醋酸銨，10 mmol／L醋酸銨的水溶液對8 種甜味劑響應情況的影響。結果發現，水相加入醋酸銨溶液后色譜峰形普遍提高，但是響應強度大大減小，而且緩沖鹽體系容易造成對色譜柱和泵的堵塞［16］，故選擇水相中不添加緩沖鹽。又因安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜、紐甜等化合物呈堿性，容易與C18柱殘留硅醇基發生吸附作用造成峰拖尾［17］，所以考慮在水相中添加體積分數為0.05%的甲酸和體積分數為0.1%的甲酸。結果發現，水相中添加甲酸后，弱酸性流動相確實改善了化合物的拖尾現象，但是化合物的響應強度大大降低，故最終選擇純水-甲醇作為流動相。經過反復優化，8 種甜味劑的提取離子流圖如圖1所示。

圖1 8種甜味劑的提取離子流圖（mg／L）

2.1.2 柱溫箱溫度選擇

考察了柱溫箱溫度為20，25，30，35，40 ℃時，對8種甜味劑響應強度的影響。結果發現，5 種柱溫箱溫度下8 種甜味劑的響應強度無明顯差別。一般認為提高柱溫雖然可以縮短分析物的分離時間，但是分析物的分離度可能隨之下降。所以，不特別設置柱溫箱溫度，柱溫箱溫度接近儀器室室溫，即22 ℃左右。

2.2 質譜條件的優化

2.2.1 一級質譜正負離子采集范圍的確定

盡管阿斯巴甜、阿力甜、紐甜在正、負離子模式下都可以得到很好的響應，但是糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜在正離子模式下響應不好，因此本文選擇使用負離子電離模式采集數據。

2.2.2 一級質譜傳輸區電壓的確定

比較了傳輸區電壓為80，100，120，140，160，180 V時對8 種甜味劑響應強度的影響。結果發現，化合物的響應強度隨著傳輸區電壓的升高呈現先增加再降低的情況；紐甜和甜菊糖苷在180 V時響應強度最高，略高于120 V 和140 V 時的響應強度；另外6 種甜味劑在120 和140 V響應強度最高。實驗又進一步考察了傳輸區電壓為120，130 和140 V時8 種甜味劑的響應強度，綜合考慮8 種甜味劑的響應情況，最終確定將傳輸區電壓設置為130 V。

2.2.3 采集二級質譜數據提高定性能力

未避免因基質復雜而導致假陽性的情況發生，在進行一級質譜全掃描得到8 種甜味劑的精確質量數及保留時間后，將碰撞能量設置為10～40 eV，延遲時間設置為1 min，得到target MSMS 二級質譜模式下每種甜味劑的二級質譜圖及其特征碎片，見表1。采集二級質譜數據進一步提高了定性能力，避免了假陽性樣品情況的發生。

表1 8 種甜味劑的色譜、質譜信息、檢出限和定量限

2.3 線性范圍和檢出限

用純水溶液配制一系列標準樣品，濃度分別為1、2.5、5、10、25、50、100 μg／L，在已優化的色譜與質譜條件下，以對照溶液的質量濃度（X，μg／L）為橫坐標，以色譜峰面積（Y）為縱坐標對目標化合物進行定量。以3 倍儀器檢測信噪比（S／N＝3）計算各化合物的定性篩查檢出限（LOD），以10 倍信噪比（S／N＝10）計算定量限（LOQ），見表2。8 種甜味劑在相應線性范圍內關系良好，相關系數R2≥0.999 0，檢出限≤1 μg／L，8 種甜味劑的定量限均≤2.5 μg／L。

表2 8 種甜味劑在不同加標水平下的回收率及相對標準偏差%

2.4 加標回收試驗

為考察本方法的準確性，對實際樣品中添加低、中、高3 個濃度水平的目標化合物混合標準溶液，每個添加水平平行測定6 次，得到不同添加水平下8 種甜味劑的回收率和相對標準偏差。結果表明，在不同的加標水平下，8 種甜味劑的平均回收率在83.9%～111%，相對標準偏差小于3.9%，各甜味劑的回收率和相對標準偏差如表2 所示。

2.5 實際樣品中安賽蜜等8 種甜味劑定性定量分析

購買市售10 份飲料，其中包括6 種碳酸飲料，分別編號1＃～6＃，以及4 種茶飲料，分別編號7?！?0＃。樣品經過1.3 中步驟進行前處理，并根據優化后的測試條件進行檢測。通過對該8 種甜味劑提取色譜圖的峰面積進行積分，得到每種甜味劑的濃度含量，結果如表3 所示。該8 種甜味劑檢出的濃度范圍為0.18～291 mg／L。6 種碳酸飲料中檢出5 個樣品含有該8 種甜味劑，其中1＃，3＃，4＃，5＃和6＃樣品中均含有安賽蜜和三氯蔗糖，其含量有較大差異。1＃樣品中除含有安賽蜜和三氯蔗糖以外還含有阿斯巴甜。所有茶飲料均未檢測出該8 種甜味劑。

表3 實際樣品檢出8 種甜味劑的含量 mg／L

2.6 實際樣品中新橙皮甙二氫查爾酮等10 種甜味劑的定性分析

本研究在查閱大量文獻的基礎上，結合中國食品常見甜味劑的種類，利用新方法對新橙皮甙二氫查爾酮、甜菊雙糖苷、愛德萬甜、甘素、麥芽糖醇、D-山梨糖醇、D-甘露糖、赤鮮糖醇、甘草酸、18β-甘草酸10 種甜味劑進行了定性分析。結果發現，1＃樣品中含有新橙皮甙二氫查爾酮和麥芽糖醇；3＃和4＃樣品中含有D-甘露糖；5＃、7＃和8＃樣品中含有麥芽糖醇；6＃樣品中含有愛德萬甜。

3 結語

本文建立了UPLC-QTOF-MS 直接檢測碳酸飲料和茶飲料中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、甜菊糖苷8 種甜味劑的方法，并對市售的10 種飲料進行了檢測。所測飲料樣品中，5 種碳酸飲料被檢出含有該8 種甜味劑，分別是安賽蜜、阿斯巴甜和三氯蔗糖，茶飲料中均未檢測到該8 種甜味劑。

利用UPLC-QTOF-MS 不依靠標準品也能定性分析的特點對文獻中報道過的另外10 種甜味劑進行了分析，得到了更全面而可靠的結果。

該方法簡便、準確、靈敏，可為市售碳酸飲料和茶飲料中甜味劑的篩查和檢測提供方法參考。