一株耐冷微生物的分離鑒定及降解特性研究

孫梓軒，陳亞軍

（定西市食品檢驗檢測中心，甘肅 定西 743000）

耐冷菌是一類能在低溫環境下正常生長的微生物，其最適生長溫度一般高于15 ℃，最高生長溫度高于20 ℃，在0～5 ℃也能正常繁殖。耐冷微生物在環境中分布廣泛，研究發現，從常溫土壤、低溫污水、人工濕地、活性污泥等環境中均可分離出耐冷菌。目前已知的耐冷微生物以細菌居多，最常見的是假單胞菌屬，耐冷真菌中以酵母菌最為常見。目前，耐冷菌研究逐漸從前期的分離鑒定和耐冷機制向應用方面擴展，尤其是北方寒冷地區生活污水、工業污水、養殖污水等方面的應用研究較多。研究結果均表明，耐冷菌在低溫環境下對廢水中的COD能達到較高的降解效率，應用前景較好。

近年來，甘肅省定西市以馬鈴薯為原料的淀粉和淀粉制品加工企業日益壯大，淀粉加工會產生大量的高濃度有機廢水，其COD含量高，超過30 000 mg/L。生物法是目前污水處理的主要方法，通過微生物的代謝和一系列酶促反應作用，使廢水中的有機物質被降解利用，從而降低廢水中的COD含量，使污水得到凈化。但是，低溫環境往往使微生物活性受到抑制，降低了微生物的生長代謝，導致低溫條件下的污水處理效果差。定西市淀粉生產集中在每年10—11月，此時環境溫度小于10 ℃，這給淀粉廢水的生物處理帶來較大困難。本研究從低溫儲藏食品漿水中分離并篩選對廢水具有較高降解能力的耐冷菌株，這對提高本地區低溫環境下淀粉廢水的處理效果具有重要意義。

1 試驗材料和方法

1.1 材料

本試驗菌種從甘肅省定西市的傳統特色食品漿水樣品中分離得到。培養基分為Luria-Bertani（LB）培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基，二者購于北京陸橋生物技術有限責任公司；NaCl、NaHPO、KHPO（分析純）購于國藥集團化學試劑有限公司；生化鑒定反應試管購于廣東環凱生物科技有限公司。馬鈴薯淀粉加工廢水樣品采自定西市臨洮縣云鵬薯業有限責任公司，其初始COD約為45 000 mg/L。

1.2 儀器與設備

一是SPX-350B智能型生化培養箱，由上海瑯玕試驗設備有限公司生產；二是JA5003電子天平，由上海良平儀器儀表有限公司生產；三是EX30光學顯微鏡，由寧波舜宇光電信息有限公司生產；四是K6600B全波長酶標儀，由北京凱奧科技發展有限公司生產；五是SP-756P紫外分光光度計，由上海光譜儀器有限公司生產。

1.3 方法

1.3.1 耐冷菌株的分離純化

將采集的漿水樣品搖勻，然后取1 mL進行10倍系列稀釋。稀釋液為無菌生理鹽水。接著，選取10～10倍的稀釋液各0.1 mL涂布于LB培養基和PDA培養基平板上，每個稀釋度設3個平行樣，于5 ℃下培養至有菌落生長，挑取生長狀況較好的單菌落反復分離純化，記錄所篩選耐冷菌株的形態特征。純化后的菌落用超低溫冷凍保存法儲存。

1.3.2 耐冷菌株的篩選

將分離純化的耐冷菌株于溫度10 ℃、轉速140 r/min的條件下振蕩培養48 h后，按照10%接種量接種于50 mL淀粉廢水中，以不加菌液的淀粉廢水為空白對照，10 ℃、140 r/min條件下培養，每組設3個重復樣，每3 d取樣測定廢水的COD值，直至COD值不再下降，然后選取對廢水COD具有較好降解性能的菌株進行鑒定。COD的測定采用《水質 化學需氧量的測定 快速消解分光光度法》（HJ/T 399—2007）。

1.3.3 耐冷菌株的鑒定

對篩選得到的耐冷菌株進行生理生化特性研究，同時進行分子生物學鑒定，細菌采用16SrDNA序列鑒定，一級酵母采用26SrDNA序列鑒定，測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，檢測序列通過美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫進行比對，采用MEGA-X軟件繪制系統發育樹。

2 試驗結果分析

2.1 耐冷菌株的分離純化

漿水樣品經過5 ℃低溫培養，共分離出4株耐冷菌株，分別命名為J1、J2、J3和J4，經過顯微鏡初步觀察，J2為革蘭氏陽性球菌，其余疑似酵母菌。平板純化培養發現，J1、J4菌株具有明顯的生長優勢，選取這兩株菌株進行進一步篩選。從菌株在PDA培養基平板上的菌落形態來看，J1菌落為圓形，呈瓷白色，表面干燥粗糙，不透明，邊緣整齊；J4為圓形，屬于絨毛樣白色凸起菌落，表面粗糙，干燥，邊緣整齊，不透明。

2.2 耐冷菌株的篩選

J1、J4菌株以及不加菌株的空白對照組對淀粉廢水COD的去除率如圖1所示。在處理的第6天，對照組COD去除率較高，達到66.11%；J1菌株處理組也顯示出較高的COD去除率，達到50.88%，但低于對照組。隨著培養時間的延長，J4菌株處理組對淀粉廢水COD的去除率逐漸增加，處理第9天的COD去除率達到79.14%，統計學差異分析結果顯示，其和對照組的COD去除率差異顯著（概率小于0.05）。結果說明，所用淀粉廢水中存在土著耐冷微生物，它們自身具有降解淀粉廢水中有機物質的能力，因此對照組也顯示出較高的降解效率，而且土著微生物可能會和加入的外來菌株產生一定的拮抗反應，從而影響菌株的廢水處理效果，所以耐冷菌株的篩選除了自身降解性能外，還需要考慮其和廢水中土著微生物的相互作用。另外，有些菌株在生長過程中會產生部分對自身生化反應有負反饋作用的代謝產物，從而抑制生化反應。因此，結合低溫生長優勢，本研究選擇J4菌株進行后期鑒定。

圖1 耐冷菌株在10 ℃低溫環境下對淀粉廢水COD的去除率

2.3 菌株鑒定

2.3.1 生理生化鑒定

對所分離菌株J4進行硝酸鹽還原、尿素水解、明膠水解、淀粉水解、觸酶試驗、糖發酵（葡萄糖、核糖、果糖、木糖等）試驗等生理生化特性研究。其中，觸酶、葡萄糖、木糖、半乳糖反應結果為陽性，其余項目反應結果為陰性。

2.3.2 分子生物學鑒定

將J4菌株26SrDNA基因序列進行同源性比對分析，結果發現，與該菌株同源性較高的大部分屬于地霉屬（sp.）菌株，其與白地霉（）的同源性高達99.8%，結合菌株形態特征和生理生化特性，菌株J4被初步鑒定為白地霉，屬于酵母菌中的地霉屬。

3 結論

漿水是在各種微生物作用下發酵而成的酸味地方特色食品，為了保持風味，成品漿水一般在低溫環境儲存，這也為耐冷微生物的生長提供了溫床。因此，本研究從漿水中分離出一株耐冷菌株J4，其對馬鈴薯淀粉加工廢水的COD具有較好的降解效果，在10 ℃溫度下，處理第9天的COD去除率可達到79.14%。通過26SrDNA基因序列和同源性比對，結合生理生化特性，初步確定菌株J4屬于白地霉。本研究所用淀粉廢水為從廠家實地采集的馬鈴薯淀粉加工過程的工藝段廢水，也被稱為蛋白液，其含有大量的蛋白質、多糖、礦物質等，它們成為淀粉廢水的主要污染源，其COD含量保持在39 000～45 000 mg/L。豐富的營養物質加之低溫環境，使得淀粉廢水含有復雜的土著耐冷微生物。本研究的對照組對淀粉廢水COD的去除率在第6天可達66.11%，也佐證了這一觀點。土著微生物的存在可能會對外加菌株的處理效果產生影響，因此利用耐冷菌株在低溫環境處理淀粉廢水時，要關注土著微生物和不同耐冷菌株的相互作用。