pcDNA3.1-HisB-MEG3 體外表達(dá)載體的構(gòu)建及分析驗(yàn)證

宋昕宇，羅錦堂，郭若楠，李 新

（天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院/天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

在生命過程中起著至關(guān)重要作用的生物大分子及其結(jié)構(gòu)、功能和組成，一直以來都是科學(xué)家們熱忱探索的課題。生命的基本過程就是從DNA 轉(zhuǎn)錄成RNA，再翻譯成蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮生物學(xué)功能的過程，其中RNA 的編碼尤為重要。科學(xué)家們把RNA 分成編碼RNA 和非編碼RNA(Non-coding RNA)，其中長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)占將近98%。近十年來，隨著對(duì)lncRNA 研究的深入，越來越多的研究成果證明了lncRNA 不是基因組上的“ 噪音”，其在諸多生命活動(dòng)進(jìn)程和新陳代謝過程中具有極其重要的作用。

作為一個(gè)已有大量研究的lncRNA，MEG3(Maternally Expressed Gene 3)，又 稱GTL2 (gene trap locus 2)基因，于2000 年首次被Miyoshi 等人報(bào)道，是一個(gè)lncRNA，并且是一個(gè)母系印記基因。MEG3一般位于染色體末端Dlk1-Dio3 印跡區(qū)內(nèi)，人的14q32 染色體上。在小鼠上位于12 號(hào)染色體，在綿羊上位于18 號(hào)染色體，在牛上位于21 號(hào)染色體，并且小鼠MEG3 基因與人類具有同源性。

在人類醫(yī)學(xué)方面，己有研究表明lncRNA MEG3在2 型糖尿病患者胰島中表達(dá)異常。同時(shí)，MEG3是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制功能的lncRNA，它在人類的正常組織中廣泛表達(dá)。MEG3 還可以通過多種途徑抑制細(xì)胞增殖，是一個(gè)重要的腫瘤抑制因子，與多種惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

在維持動(dòng)物有機(jī)體骨骼肌發(fā)育發(fā)面，MEG3 同樣扮演著重要的調(diào)控角色，它可以顯著促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的分化，調(diào)控骨骼肌的發(fā)育過程。MEG3 在小鼠骨骼肌發(fā)育過程中呈現(xiàn)顯著變化，它對(duì)C2C12 細(xì)胞的分化具有促進(jìn)作用，而過表達(dá)MEG3 對(duì)C2C12 細(xì)胞的增殖具有抑制作用。MEG3 可以促進(jìn)小鼠、豬、牛、羊等動(dòng)物肌肉細(xì)胞的分化，抑制細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)肌肉分化抑制因子。因此，MEG3 可作為畜牧業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的分子標(biāo)記。

有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在氧化應(yīng)激反應(yīng)中起到一定的作用，然而，關(guān)于lncRNA 在氧化損傷小鼠肌肉中表達(dá)情況尚不清楚。羅海靜等挑選了5 種與氧化應(yīng)激有關(guān)的LncRNA，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3 在氧化損傷小鼠肌肉中的表達(dá)最高，這一研究充分證明了lncRNA MEG3 對(duì)損傷肌肉的修復(fù)起著很大作用。楊睿分別構(gòu)建了2 種MEG3 的體外表達(dá)載體pcDNA3.1-MEG3-TTCC和pcDNA3.1-MEG3-CCCA，并將這2 種體外表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中，再對(duì)lncRNA MEG3 的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示這2 種體外表達(dá)載體均能在體外進(jìn)行表達(dá)，且pcDNA3.1-MEG3-TTCC 組的表達(dá)量顯著高于pcDNA3.1-MEG3-CCCA 組。該研究說明，這2 種MEG3 的體外表達(dá)載體都能在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化過程中起著重要的調(diào)控作用。這一試驗(yàn)為lncRNA MEG3 對(duì)豬骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控作用的研究提供了充足的理論依據(jù)。

因此，無論是在癌癥或腫瘤等疾病方面，還是在骨骼肌的分化和發(fā)育方面，lncRNA MEG3 都扮演著重要的角色。在前期的研究中，筆者對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)、翻譯組學(xué)及微肽組學(xué)3 個(gè)組學(xué)的測(cè)序分析，經(jīng)過多組學(xué)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)MEG3 具有小的開放閱讀框（sORF）結(jié)構(gòu)，并在微肽組學(xué)中發(fā)現(xiàn)與之預(yù)測(cè)氨基酸序列對(duì)應(yīng)的微肽產(chǎn)物，因此，初步判斷MEG3 可能具有編碼能力，可以編碼產(chǎn)生功能性微肽。鑒于此，我們?cè)O(shè)計(jì)擴(kuò)增了牛MEG3 基因ORF 區(qū)的編碼序列，構(gòu)建了融合蛋白載體pcDNA3.1-HisB-MEG3，把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，檢測(cè)其外源表達(dá)情況，為后續(xù)開展更深入的MEG3 功能探究提供材料和夯實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)也為深入篩選驗(yàn)證具有編碼產(chǎn)物的lncRNA 提供技術(shù)支持和佐證材料。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來源

293T 細(xì)胞、牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(BSMSCs)均為天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.2 質(zhì)粒

質(zhì)粒載體為帶有His 表達(dá)標(biāo)簽的pcDNA3.1-HisB（圖1），購自武漢淼靈生物科技有限公司。

圖1 空載質(zhì)粒pcDN3.1-HisB 基本結(jié)構(gòu)圖

1.3 試劑與耗材

試驗(yàn)用主要試劑和耗材見表1。

表1 試驗(yàn)所需主要試劑和耗材

1.4 儀器設(shè)備

CO培養(yǎng)箱（Thermo-scientific）；Light Cycle 96熒光定量PCR 儀（Roche）；超敏電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）；制冰機(jī)（SANYO）；電泳儀（Bio-Rad）；恒溫循環(huán)水浴鍋（德國勞達(dá)貿(mào)易有限公司）；高壓滅菌鍋（TOMY）；渦旋振蕩器（德國艾卡公司）；電子天平（美國奧豪斯公司）；超純水制造系統(tǒng)（優(yōu)普）；恒溫?fù)u床（IKA）。

1.5 核苷酸序列

依據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、翻譯組學(xué)及微肽組學(xué)多組學(xué)分析結(jié)果獲得MEG3 的ORF 核酸序列信息，體外合成末端帶有XhoI 和XbaI 酶切位點(diǎn)的目標(biāo)片段序列。目的片段由金開瑞生物科技有限公司合成。

1.6 MEG3 外源表達(dá)載體構(gòu)建

將MEG3 ORF 區(qū)的體外合成片段與pcDNA3.1-HisB 空載質(zhì)粒分別用限制性核酸內(nèi)切酶XhoI 和XbaI 進(jìn)行雙酶切處理（酶切體系見表2），37 ℃水浴20 min。酶切產(chǎn)物利用DNA 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化回收。調(diào)整純化后的目的片段與空載質(zhì)粒pcDNA3.1-HisB 的比例為質(zhì)粒∶目的片段=1∶3，利用T4 連接酶進(jìn)行連接，反應(yīng)條件為22 ℃2 h，4 ℃過夜。隨后將連接產(chǎn)物按照1∶10 的比例加入預(yù)先解凍的感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌在37 ℃搖床中復(fù)活1 h。隨后鋪30 uL 于Amp 平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)10～12 h。挑取單克隆菌落接種于5 mL含有氨芐青霉素（1∶1 000）的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，將驗(yàn)證正確的陽性轉(zhuǎn)化子送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序引物為F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG；R：TAGAAGGCAC AGTCGAGG。利用DNA MAN 軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，測(cè)序結(jié)果正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，獲得pcDNA3.1-HisB-MEG3 的體外表達(dá)載體。

表2 DNA/pcDNA3.1-HisB 酶切體系

1.7 目標(biāo)微肽體外表達(dá)

1.7.1 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究使用293T 細(xì)胞系進(jìn)行MEG3 的體外表達(dá)，使用BSMSCs 進(jìn)行RNA 水平的定量檢測(cè)。

細(xì)胞復(fù)蘇：取出實(shí)驗(yàn)室凍存的細(xì)胞，37 ℃水浴1～2 min 迅速解凍復(fù)蘇，加入1 mL 完全培養(yǎng)基（20%FBS+DMEM），離心后棄上清，加入3 mL 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入60 mm 培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞數(shù)量及生長情況。

細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞生長至匯合率達(dá)到80%～90%時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。棄培養(yǎng)基，加入1 mL 胰酶，37 ℃靜置消化2 min，加入1 mL 完全培養(yǎng)基中和胰酶，輕吹重懸細(xì)胞，吸取細(xì)胞懸液離心，棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,按照適當(dāng)比例接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。持續(xù)觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.7.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 待293T 細(xì)胞融合度達(dá)到80%，依據(jù)Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑的說明書要求轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HisB-MEG3 質(zhì)粒和對(duì)照組pcDNA3.1-HisB 空質(zhì)粒（NC）。每組試劑設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

使用opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋lipofectamine 3000、P3000 和載體質(zhì)粒。293T 細(xì)胞由無抗培養(yǎng)基培養(yǎng)。12 孔板1 孔配置方法A：62.5 μL opti-MEM+3.75 μL lip 3000；B：62.5 μL opti-MEM +2.5 μL P3000+cDNA3.1-HisB-MEG3/pcDNA3.1-HisB 空質(zhì)粒（NC），加入1 250 ng 質(zhì)粒。將上述試劑室溫孵育5 min，隨后A、B 兩管中試劑混合均勻再次孵育10 min。加入到293T 細(xì)胞培養(yǎng)皿中輕晃搖勻。轉(zhuǎn)染6 h 后更換為有抗培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后24 h 分別收集細(xì)胞mRNA 和蛋白樣品，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.8 目標(biāo)微肽驗(yàn)證與鑒定

1.8.1 細(xì)胞總RNA 提取及外源微肽mRNA 表達(dá)鑒定 采用RNA 快速提取試劑盒分別抽提上述轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-HisB-MEG3 質(zhì)粒和對(duì)照組pcDNA3.1-HisB 空質(zhì)粒的293T 細(xì)胞（24 孔板中培養(yǎng)）的總RNA，按照HiFiScript cDNA Synthesis Kit 說明書進(jìn)行cDNA 的合成，反轉(zhuǎn)錄體系見表3。反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃15 min，85 ℃5 min。

表3 反轉(zhuǎn)錄體系

以GAPDH 為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)MEG3 融合蛋白的mRNA 表達(dá)情況。引物序列F：ATGTTTTTCCCAAACAGGTTGGTC；R：TTATTGGAGCTCGGAGACGG。每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.8.2 細(xì)胞總蛋白提取及Western blot 分析 利用RIPA 蛋白裂解液裂解并收集分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HisB-MEG3 質(zhì)粒及pcDNA3.1-HisB 空質(zhì)粒（NC）的293T 細(xì)胞的總蛋白樣品。將含有外源表達(dá)蛋白的細(xì)胞總蛋白通過12%SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳分離，隨后300 mA 轉(zhuǎn)膜2 h。用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉PVDF 膜2 h，根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量大小剪取PVDF 膜，并用適當(dāng)一抗（anti-His 抗體/DAPDH抗體）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜后用熒光標(biāo)記二抗（Secondary Antibodies-Goat Anti-Rabbit Mouse IgGHRP）室溫孵育1 h。按照1∶1 的比例配置ECL 超敏發(fā)光液，并在超敏電泳凝膠成像分析系統(tǒng)下拍照保存。分析目的蛋白表達(dá)情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)qRT-PCR 結(jié)果進(jìn)行t 檢驗(yàn)分析，按2Ct 計(jì)算，GAPDH 基因作為內(nèi)參對(duì)檢測(cè)的目的基因進(jìn)行歸一化處理。“ *”表示差異顯著（P＜0.05），“ **”表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 pcDNA3.1-HisB-MEG3 表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果

在前期研究中，筆者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3 可能具有編碼潛能，能編碼產(chǎn)生微肽，為驗(yàn)證這一結(jié)果，筆者利用前期的微肽組學(xué)結(jié)果和生物信息學(xué)手段，分析獲得了lncRNA MEG3 可能的ORF 區(qū)，該ORF 區(qū)長度為555 bp，可能編碼產(chǎn)生長度為185 aa的微肽（圖2）。因此，筆者人工合成了末端帶有XhoI、XbaI 酶切位點(diǎn)的lncRNA MEG3 的ORF 區(qū)序列（圖3），為了方便后續(xù)試驗(yàn)，筆者在起始密碼子后同時(shí)添加了6×His 以及3×Flag 小分子標(biāo)簽，再將其連入帶有His 蛋白表達(dá)標(biāo)簽的pcDNA3.1-HisB 質(zhì)粒中，以增加檢測(cè)的敏感性。由圖4 可知，本研究選擇pcDNA3.1-HisB 空載質(zhì)粒作為載體，經(jīng)過XhoI、XbaI 雙酶切，可將目的片段連接在空載質(zhì)粒pcDNA3.1-HisB 上，從而在細(xì)胞中表達(dá)MEG3 蛋白。質(zhì)粒中含有T7 啟動(dòng)子，可大量轉(zhuǎn)錄表達(dá)目標(biāo)蛋白，6×His 標(biāo)簽位于目的基因MEG3 的上游，經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲得了全長6 167 bp 的pcDNA3.1-HisB-MEG3融合載體。

圖2 目的片段核苷酸序列

圖3 MEG3 的ORF 區(qū)序列

圖4 pcDNA3.1-HisB-MEG3 重組質(zhì)粒圖譜

為驗(yàn)證pcDNA3.1-HisB-MEG3 融合載體序列的正確性，利用XhoI、XbaI 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物及重組質(zhì)粒進(jìn)行凝膠電泳，如圖5 所示，泳道1 是經(jīng)過雙酶切的重組質(zhì)粒，在該泳道中形成一個(gè)長度為644 bp 的帶有目的片段的條帶以及一個(gè)長度為5 523 bp 的不含目的基因的條帶，2 個(gè)條帶的長度均符合要求。由此可以初步判斷，pcDNA3.1-HisB-MEG3 表達(dá)載體構(gòu)建成功。同時(shí)，設(shè)計(jì)lncRNA MEG3 ORF 區(qū)序列的特異性引物，對(duì)pcDNA3.1-HisB-MEG3 的融合載體進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果如圖6 所示，序列完全匹配，說明pcDNA3.1-HisB-MEG3 表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖5 pcDNA3.1-HisB-MEG 重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

圖6 pcDNA3.1-HisB-MEG3 測(cè)序結(jié)果

2.2 細(xì)胞中pcDNA3.1-HisB-MEG3 mRNA 的表達(dá)檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證pcDNA3.1-HisB-MEG3 在BSMSCs 中的過表達(dá)情況，于BSMSCs 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HisB 空載體（NC）和pcDNA3.1-HisBMEG3 表達(dá)載體24 h 后，提 取BSMSCs 增殖期總RNA，檢測(cè)與對(duì)照組相比pcDNA3.1-HisB-MEG3 表達(dá)水平的變化。如圖7 所示，外源轉(zhuǎn)入的pcDNA3.1-HisB-MEG3 在BSMSCs 細(xì)胞中其mRNA 表達(dá)量比NC 對(duì)照組高約23 倍，差異極顯著。因此，可以初步判斷在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中 pcDNA3.1-HisB-MEG3 重組載體mRNA 可以正常表達(dá)。

圖7 MEG3 mRNA 表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

2.3 考馬斯亮藍(lán)定性檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況

本研究驗(yàn)證了pcDNA3.1-HisB-MEG3 在293T細(xì)胞中的mRNA 表達(dá)水平后，利用考馬斯亮藍(lán)染色對(duì)pcDNA3.1-HisB-MEG3 編碼的微肽在蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行了初步檢測(cè)。前期預(yù)測(cè)出MEG3 ORF 序列編碼一個(gè)185 aa 的微肽，將其連入pcDNA3.1-HisB 載體后其編碼的微肽-His 標(biāo)簽融合蛋白的大小約為17 kDa。考染結(jié)果如圖8 所示，帶有目的基因MEG3 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后，在25～35 kDa 處（圖中方框處）具有明顯的蛋白條帶，而NC組無明顯條帶，這說明pcDNA3.1-HisB-MEG3 在293T 細(xì)胞中表達(dá)了融合蛋白產(chǎn)物，證明其能在蛋白水平進(jìn)行表達(dá)。

圖8 293T 細(xì)胞中考馬斯亮藍(lán)染色定性檢測(cè)MEG3 的蛋白表達(dá)水平

2.4 Western blot 試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證MEG3 微肽融合蛋白的外源表達(dá)，利用His 標(biāo)簽蛋白的特異性His 抗體進(jìn)行了Western blotting 分析。結(jié)果如圖9 所示，His 抗體孵育后，在pcDNA3.1-HisB-MEG3 轉(zhuǎn)染組檢測(cè)到明顯的特異性條帶，而NC 對(duì)照組沒有檢測(cè)到條帶，說明本研究構(gòu)建的pcDNA3.1-HisB-MEG3 在293T 細(xì)胞中融合蛋白成功表達(dá)。

圖9 293T 細(xì)胞中Western blot 檢測(cè)MEG3 的蛋白表達(dá)水平變化

3 結(jié)論與討論

IncRNA 是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 個(gè)核苷酸的RNA 分子，是轉(zhuǎn)錄組的主要組成部分，它正在成為調(diào)控發(fā)育進(jìn)程中的核心參與者。同時(shí)，生物體基因組可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生數(shù)目巨大、形式各異和功能不同的lncRNA 分子。已有研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄lncRNA分子的基因來源于生物體基因組上的許多區(qū)域，并且多數(shù)lncRNA 分子序列上都含有小的、未被注釋過的開放閱讀框序列。越來越多的研究表明這些缺少蛋白編碼潛能的lncRNA 分子可以翻譯成為多肽分子并參與相關(guān)的生命活動(dòng)。

胡艷妹等研究發(fā)現(xiàn)，MEG3 在胰島β 細(xì)胞高表達(dá)，具有組織特異性。干擾MEG3 后，小鼠葡萄糖耐受能力受損，血清胰島素水平降低，胰島素合成能力下降。初步證實(shí)，MEG3 可以通過參與胰島素的合成和分泌來維持成年小鼠胰島功能，進(jìn)一步豐富和完善了胰島發(fā)育和功能維持的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。程寧等研究發(fā)現(xiàn)，MEG3 可促進(jìn)白細(xì)胞介素1β 誘導(dǎo)的大鼠椎間盤髓核細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，揭示了MEG3 對(duì)大鼠椎間盤髓核細(xì)胞增殖及凋亡的分子機(jī)制起著決定性作用，進(jìn)一步奠定了MEG3 的研究基礎(chǔ)。

在骨分化和形成方面，有研究表明，MEG3 的表達(dá)上調(diào)能抑制骨的自噬，從而抑制成骨分化和骨形成代謝。同時(shí)，還有不少研究表明，在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3 能夠促進(jìn)牛原代骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化。在對(duì)動(dòng)物生長發(fā)育性狀的研究方面，通過剖析4 個(gè)綿羊品種的MEG3 基因的不同基因型和單倍型對(duì)生長發(fā)育的影響表明，MEG3 基因的不同基因型和單倍型在灘羊的體高、體長和胸圍性狀上存在顯著差異，說明MEG3 對(duì)于綿羊生長發(fā)育性狀有影響。

除了在動(dòng)物上的研究和試驗(yàn)，在人類醫(yī)學(xué)以及各種疾病的研究中，大量研究結(jié)果表明，MEG3 在預(yù)測(cè)宮頸癌患者腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面具有足夠的敏感性和特異性，MEG3 在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡基礎(chǔ)上與宮頸癌的進(jìn)展有關(guān)。因此，MEG3 可能是宮頸癌的一個(gè)潛在診斷工具和預(yù)后標(biāo)志物。同時(shí)，MEG3 甲基化不僅是宮頸癌的危險(xiǎn)因素，也是HR-HPV 感染和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。更多研究表明，MEG3 在多種癌癥中丟失，包括膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、胃癌和膀胱癌。因此，無論是在農(nóng)業(yè)科學(xué)還是人類科學(xué)方面，MEG3 都有著巨大的研究價(jià)值。

為了后續(xù)在lncRNA 中針對(duì)MEG3 基因展開相關(guān)研究，本試驗(yàn)成功構(gòu)建MEG3 的融合蛋白載體pcDNA3.1-HisB-MEG3，并能夠在外源的293T 細(xì)胞中正常表達(dá)，為判斷MEG3 對(duì)腫瘤和癌癥及其他疾病中潛在作用的研究夯實(shí)理論基礎(chǔ)，同時(shí)也說明lncRNA MEG3 在骨骼肌的生長發(fā)育中起著重要作用，有利于揭示部分非編碼RNA 也具有編碼潛能這一重要論題。