缺氧誘導前列腺基質細胞HIF-1α與自噬在前列腺癌中的作用與機制研究

黃光毅 白俊超 蔣則平 朱武安

我國前列腺癌的發病率逐年升高。目前，傳統的前列腺癌治療方案為雄激素剝奪治療（androgen deprition treatment，ADT），包括藥物抗雄激素以及手術去勢，以阻止雄激素結合到雄激素受體上的方式來抑制前列腺癌的生長。然而，傳統的藥物治療并不能完全抑制前列腺癌的進程，大多數前列腺癌患者在經過ADT治療后均會以非激素依賴的方式復發［1-4］。研究表明，前列腺增生的發生不僅與雄性激素和老齡有關，而且可能與前列腺細胞相對缺氧密切相關［5-6］。缺氧誘導自噬，從而引起轉化生長因子-β1（TGF-β1），成纖維細胞生長因子-2（FGF-2）和FGF-7等釋放，可能在前列腺癌的發生中發揮重要作用［7-9］。低氧誘導因子-1（hypoxiainducible factor-1，HIF-1）可激活目的基因的轉錄，調控生物體內的氧平衡，對機體器官或局部組織適應低氧環境具有重要作用［10-12］。本研究探討HIF-1α在缺氧誘導的前列腺基質細胞自噬調節與增殖分化發生的機制，為治療前列腺癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺基質永生化細胞WPWY-1，由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。

1.2 試制 DMEM培養基（添加NaHCO31.5 g/L），95%；3-MA，均由美國sigma提供；優質胎牛血清，5%，由美國Gibco提供；DMSO，由北京索萊寶提供；胰蛋白酶，由美國Promega提供；兔抗LC3 II、兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體、兔抗LC3II一抗、Beclin1單克隆抗體、內參β-actin（1∶1000）、羊抗兔HRP二抗，均由英國Abcam提供；HIF-1α靶 shRNA、DNA 寡核苷酸鏈和PCR引物由博士德公司提供；TGF-β1，FGF-2，FGF-7試劑盒，由上海慧穎提供；pShuttleH1表達載體由第三軍醫大學提供；西羅莫司、MTT、吖啶橙、PMSF、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、ECL顯影液、上樣緩沖液，均由上海碧云天提供。

1.3 實驗設備 定量PCR儀，由美國Applied Biosystems生產；電泳槽，由日本ATTO生產；雜交爐（UVP）、UVP凝膠成像系統，由美國GOS7600S生產；PCR儀，PTC-100，由美國MJ生產；蛋白/核酸分析儀，DU640，由BECKMAN生產；熒光顯微鏡及顯微成像系統，由德國AXIOSKOP生產；酶標儀，由奧地利TECAN生產；倒置熒光顯微鏡，DMI3000 B，由德國LEICA公司生產；二氧化碳培養箱、振蕩器，由賽默飛世爾科技中國有限公司生產；低溫離心機，由德國Eppendorf生產；超靈敏多功能成像儀，由美國GE Healthcare生產；恒溫培養箱，grp-9080，由美國通用公司提供。

1.4 實驗方法 （1）建立缺氧誘導的前列腺基質細胞自噬模型：前列腺基質永生化細胞WPWY-1復蘇、培養、傳代，待細胞狀態良好后，使用含有5%優質胎牛血清的DMEM培養液，于37℃，5%CO2，O2分別為5%，10%，14%，17%，20%，25%，30%，及飽和濕度下的培養箱中培養。培養2 h、4 h、8 h、16 h、24 h、48 h后通過形態學觀察，MTT分別進行前列腺基質細胞增殖檢測，Western Blot檢測細胞HIF-1α的表達，ELISA法檢測前列腺基質細胞TGF-β1，FGF-2和FGF-7的含量，以確定缺氧促進基質細胞生長的時間依賴關系和缺氧處理的最佳時間點，從而建立缺氧誘導的前列腺基質細胞自噬模型。（2）HIF-1α腺病毒載體以及靶向HIF-1α siRNA腺病毒載體的構建：①HIF-1α靶向性腺病毒載體：擴增HIF-1α基因，并在基因兩端加上Bgl II與Sal I內切酶接頭，連接至腺病毒穿梭質粒pShuttleH1，卡那霉素篩選克隆，鑒定后命名為Shuttle-HIF-1α，線性化后與Adeasy骨架質粒大腸桿菌內重組，卡那霉素篩選克隆。將其線性化后轉入HEK293細胞，放置15~20 d，凍融法裂解細胞，獲取病毒原液。利用病毒原液感染大量HEK293細胞，純化病毒顆粒，并命名為Ad-HIF-1α，滴度測定后-80℃保存。②靶向HIF-1α基因siRNA腺病毒載體：合成雙鏈寡核苷酸并克隆人pShuttleH1載體，pShuttleH1-siHIF-1α線性化后電轉化到含pAdEasy-1的BJ5183感受態細菌中獲取重組質粒，脂質體轉染HEK293細胞獲取重組腺病毒Ad-siHIF-1α，滴度測定后-80℃保存。（3）缺氧條件下自噬或HIF-1α對前列腺基質細胞增殖，以及對TGF-β1，FGF-2和FGF-7的影響：取前列腺基質永生化細胞WPWY-1，分為自噬抑制組、自噬促進組、HIF-1α上調組、HIF-1α下調組、低氧對照組，其中自噬抑制組使用含10 mmol/L自噬抑制劑3-MA、5%含優質牛胎血清DMEM培養液，自噬促進組使用含自噬促進劑西羅莫司、5%含優質牛胎血清DMEM培養液，HIF-1α上調組WPWY-1細胞轉染Ad-HIF-1α，HIF-1α下調組WPWY-1細胞轉染Ad-siHIF-1α，使用含5%含優質牛胎血清DMEM培養液，低氧對照組WPWY-1細胞不作處理，HIF-1α上調組、HIF-1α下調組、低氧對照組均使用含5%含優質牛胎血清DMEM培養液。所有組均按缺氧誘導的前列腺基質細胞自噬模型培養條件進行培養。檢測各組細胞增殖、自噬率，及HIF-1α，LC3 II，Beclin1，TGF-β1，FGF-2和FGF-7的表達。（4）檢測方法：①MTT法檢測WPWY-1細胞增殖活力：將WPWY-1細胞按1×104/孔種植到96孔板中，加入MTT20 μL，培養4 h，向每孔加入DMSO 150 μL，采用酶聯檢測儀570 nm波長測定吸光度A，以吸光度A評價細胞增殖活力。② Western Blot檢測細胞HIF-1α、LC3 II、Beclin1的表達［13］：使用冷PBS清洗WPWY-1，裂解細胞提取總蛋白，采用Bradford法測定蛋白濃度，蛋白變性后每孔上樣量為20μg，以100 V 8%聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗滌后分別加入兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體（1∶500）、兔抗LC3II一抗（1∶1,000）、Beclin1單克隆抗體（1∶1,000）和內參β-actin（1∶1,000）4℃孵育過夜，羊抗兔HRP二抗（1∶10,000），室溫孵育45 min。洗膜后ECL 顯影，壓片5 min，定影。掃描膠片后，采用Image J軟件對圖片進行分析，WPWY-1細胞HIF-1α表達水平為目標條帶與內參條帶的面積比值。③ELISA法檢測TGF-β1，FGF-2和FGF-7的含量：收集WPWY-1細胞上清液，嚴格按照TGF-β1、FGF-2、FGF-7 ELASA試劑盒使用說明進行操作，測定上清液中 TGF-β1，FGF-2和FGF-7的含量。④自噬率的測定及計算［14］：所有組WPWY-1細胞于培養結束前0.5 h，在細胞培養液加入1μg/mL吖啶橙染液，常溫條件下染色30 min，然后使用PBS無菌液清洗，于倒置熒光顯微鏡下觀察記錄細胞染色情況。高倍鏡下隨機觀察計數200個細胞，若細胞質內出現綠色熒光，則為自噬陰性細胞；若出現紅色酸性自噬小體，則為自噬陽性細胞。自噬陽性細胞比例為自噬率。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件。計量數據以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 缺氧誘導的前列腺基質細胞自噬模型 （1）形態學觀察：光鏡下觀察，不同氧濃度條件下培養，初期前列腺基質永生化細胞WPWY-1均呈成肌細胞樣，后隨培養時間的延長，低氧條件下WPWY-1呈現不同程度增大，且大小不均一，核呈梭形或卵圓形，多為雙層腺樣；氧充足條件下WPWY-1持續呈典型成肌細胞樣，且大小均勻。（2）WPWY-1細胞增殖活力、HIF-1α、TGF-β1，FGF-2和FGF-7：低氧條件下WPWY-1細胞增殖活力（吸光度A）明顯高于氧充足條件，其中以10%氧濃度培養24 h細胞增殖活力最高，見圖1。同時檢測HIF-1α、TGF-β1，FGF-2和FGF-7，結果與細胞增殖活力檢測結果基本一致，見圖2~5。結果表明，低氧能促進前列腺基質永生化細胞WPWY-1增殖，以氧濃度為10%，培養時間為24 h最佳。后續實驗以此培養條件建立前列腺基質細胞WPWY-1自噬模型。

圖1 不同氧濃度條件下不同時點WPWY-1細胞增殖水平

圖2 不同氧濃度條件下不同時點WPWY-1細胞HIF-1α表達水平

圖3 不同氧濃度條件下不同時點WPWY-1細胞TGF-β1表達水平

圖4 不同氧濃度條件下不同時點WPWY-1細胞FGF-2表達水平

圖5 不同氧濃度條件下不同時點WPWY-1細胞FGF-7表達水平

2.2 各組WPWY-1細胞增殖活力、HIF-1α、自噬率、LC3 II的比較 與低氧對照組比較，自噬抑制組和HIF-1α下調組WPWY-1細胞增殖活力、LC3 II、Beclin1降低（P＜0.05），自噬率增加（P＜0.05）。自噬促進組和HIF-1α上調組WPWY-1細胞增殖活力、LC3 II、Beclin1增加（P＜0.05），自噬率降低（P＜0.05）。自噬抑制組與自噬促進組比較及HIF-1α上調組與HIF-1α下調組比較，WPWY-1細胞增殖活力、自噬率、LC3 II、Beclin1，差異均有統計學意義（P＜0.05）。HIF-1α上調組和HIF-1α下調組HIF-1α比低氧對照組增加或降低（P＜0.05），但自噬抑制組與自噬促進組HIF-1α與低氧對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1，圖6。

圖6 Western blot檢測各組HIF-1α、LC3 II、Beclin1的表達量

表1 各組WPWY-1細胞增殖活力、HIF-1α、自噬率、LC3 II比較（±s）

表1 各組WPWY-1細胞增殖活力、HIF-1α、自噬率、LC3 II比較（±s）

注：與低氧對照組比較，*P＜0.05；與自噬抑制組比較，#P＜0.05；與HIF-1α上調組比較，&P＜0.05

組別 n 細胞增殖活力（A） HIF-1α（%）自噬率（%） LC3 II Beclin1低氧對照組 6 0.81±0.017 0.71±0.017 14.48±2.88 1.51±0.71 0.82±0.056自噬抑制組 6 0.72±0.040* 0.72±0.059 26.06±5.18* 0.74±0.07* 0.74±0.055*自噬促進組 6 0.89±0.013*# 0.69±0.074 8.59±1.94*# 2.30±0.14*# 0.94±0.091*#HIF-1α上調組 6 0.87±0.024* 0.81±0.037* 10.33±1.86* 2.24±0.09* 0.91±0.064*HIF-1α下調組 6 0.73±0.015*& 0.61±0.029* 17.22±2.49*& 0.78±0.11*& 0.69±0.095*&

2.3 各組WPWY-1細胞TGF-β1、FGF-2、FGF-7比較 與低氧對照組比較，自噬抑制組和HIF-1α下調組WPWY-1細胞TGF-β1，FGF-2和FGF-7降低（P＜0.05），自噬促進組和HIF-1α上調組WPWY-1細胞TGF-β1，FGF-2和FGF-7增加（P＜0.05）。自噬抑制組與自噬促進組比較及HIF-1α上調組與HIF-1α下調組比較，WPWY-1細胞TGF-β1、FGF-2、FGF-7差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組WPWY-1細胞TGF-β1、FGF-2、FGF-7比較（±s）

表2 各組WPWY-1細胞TGF-β1、FGF-2、FGF-7比較（±s）

注：與低氧對照組比較，*P＜0.05；與自噬抑制組比較，#P＜0.05；與HIF-1α上調組比較，&P＜0.05

分組 n TGF-β1（ng/mL） FGF-2（ng/mL） FGF-7（ng/mL）低氧對照組 6 450.33±11.60 423.67±10.67 364.33±8.08自噬抑制組 6 405.83±15.96* 394.83±8.57* 333.83±9.34*自噬促進組 6 487.50±14.25*# 454.17±10.41*# 384.17±9.75*#HIF-1α上調組 6 481.33±10.58* 447.50±4.92* 384.50±8.58*HIF-1α下調組 6 411.17±12.27*& 400.33±8.16*& 335.00±10.26*&

3 討論

隨著年齡的增長，人體各臟器和組織細胞的功能都會生產非疾病性的退行性改變。中老年男性的這種退行性改變，可導致前列腺血流量減少，形成前列腺組織相對缺血缺氧環境［15］。SAITO等［6］利用自發性高血壓大鼠研究前列腺血流量和前列腺增生癥的關系，發現SHR前列腺血流量降低，明顯促進前列腺癌的形成，且缺氧能夠誘導前列腺基質細胞釋放TGF-β1和FGF-2/7等生長因子。本研究采用不同氧濃度培養前列腺基質永生化細胞WPWY-1，研究發現低氧環境能增強細胞增殖分化，上調HIF-1α表達，TGF-β1，FGF-2和FGF-7等生長因子水平均明顯高于常氧或富氧環境，細胞增殖活力增加，進一步證實低氧可促進前列腺基質細胞釋放TGF-β1，FGF-2和FGF-7，從而誘導前列腺基質細胞增殖分化，并破壞前列腺上皮細胞結構，但嚴重缺氧環境細胞增殖程度受到一定限度，與文獻研究結果一致［11］。

自噬（Autophagy）是一種機體生存、分化、發育、代謝必需的溶酶體降解途徑，其主要功能是保護機體免受各種致病因素的侵襲，并參與多種疾病如肝病、癌癥、神經變性病等的發生［16-17］。低氧是誘導細胞自噬的最常見原因［18］。低氧通過限制活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產生和阻斷一磷酸腺苷活化蛋白激酶／哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（AMP-activated protein kinase/ mammalian target of rapamycin，AMPK/MTOR）信號通路，同時促進自噬信號蛋白LC3的Ⅰ型向Ⅱ型轉變，抑制過量自噬，促進髓核細胞的增殖［19-20］，其中LC3 II是細胞自噬水平的標志物。自噬抑制劑3-MA、自噬促進劑西羅莫司能抑制或促進胞質型LC3 I向自噬體膜蛋白LC3 II的轉化，從而抑制或促進自噬的激活［21］。本研究使用自噬抑制劑3-MA、自噬促進劑西羅莫司分別處理WPWY-1，發現兩組細胞增殖活力、自噬率、LC3 II、Beclin1、TGF-β1、FGF-2、FGF-7差異有統計學意義（P＜0.05），與低氧對照組比較差異也有統計學意義（P＜0.05）。表明自噬在前列腺基質細胞的增殖和分化中發揮重要作用。

低氧能誘導前列腺基質細胞增殖和釋放轉化生長因子TGF-β1，FGF-2和FGF-7，是良性前列腺增生的重要致病因素之一。而HIF-1已被確定為組織細胞適應低氧的關鍵介質，受到氧濃度水平的嚴密調節，幾乎在所有細胞類型中表達，是一種高度保守的轉錄因子，其中HIF-1α賦予低氧誘導HIF-1轉錄活性的敏感性和特異性［22-23］。有研究報道，體外、體內轉染HIF-1α均可促進肺癌細胞A549的生長，其機制可能與能促進細胞惡性增殖和抑制凋亡有關。潘克儉等［24］通過構建針對HIF-1α的人HIF-1α siRNA表達載體，轉染SW480細胞，研究發現HIF-1α在缺氧條件下，對SW480細胞的增殖有促進作用。田躍軍等［25］研究認為，HIF-1α與前列腺癌發生、發展過程密切相關，可能是前列腺癌的一個潛在的腫瘤生物標志物。本研究構建HIF-1α靶向性腺病毒載體Ad-HIF-1α、靶向HIF-1α基因siRNA腺病毒載體Ad-siHIF-1α，轉染WPWY-1細胞，研究發現通過上調或下調WPWY-1細胞HIF-1α的表達，可促進或抑制TGF-β1、FGF-2、FGF-7等細胞生長因子的釋放，從而調節WPWY-1細胞的增殖分化，其作用機制與自噬信號通路LC3 II、Beclin1有關。LC3 II和Beclin1作為自噬信號通路上的兩個重要分子，在自噬發生過程中發揮關鍵作用。本研究顯示，通過調節WPWY-1細胞HIF-1α的表達，可調控自噬信號通道蛋白LC3 II、Beclin1，調節自噬水平，從而控制TGF-β1、FGF-2、FGF-7等細胞生長因子的釋放，實現WPWY-1細胞增殖分化的調控。HIF-1α表達上調，則增強自噬信號通道蛋白LC3 II、Beclin1的表達，自噬受到抑制，TGF-β1、FGF-2、FGF-7等細胞生長因子的釋放增加，細胞增殖活力增強。反之，則細胞增殖活力降低。表明HIF-1α可能是前列腺基質細胞增殖分化的關鍵介質，其作用是通過調控自噬來實現。雖然前列腺基質細胞的增殖分化本身與前列腺癌的發生和發展無直接的關聯性。但前列腺基質細胞的增殖分化的本質是自噬，其是前列腺癌的啟動子或抑制劑，能通過PI3K/Akt/mTOR信號通路和LC3過表達，參與前列腺癌的發生和發展過程。

綜上所述，低氧誘導前列腺基質細胞HIF-1α表達上調，通過增強自噬通路中的信號蛋白Beclin1 和LC3II的表達，調控細胞自噬水平，從而促進細胞釋放TGF-β1、FGF-2、FGF-7等細胞生長因子，誘導自噬誘發前列腺基質細胞增殖分化，參與前列腺癌的進展。其中HIF-1α可能是低氧誘導自噬誘發前列腺基質細胞增殖分化的關鍵介質，有望成為前列腺癌新的治療靶點。