miR-19a對缺氧復氧誘導心肌細胞SOCS3/JAK1/STAT3信號通路及自噬的影響

陳耿仟，吳國平，洪麗明，林 潤

心血管疾病，如心力衰竭、冠心病和急性心肌梗死等與心肌結構和功能失調密切相關，嚴重威脅人類生命安全[1]。溶栓、冠狀動脈介入是治療心血管疾病的有效手段，可使病人受到不同程度的心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷[2]。因此，開發新策略預防I/R損傷對改善心血管疾病具有重要的臨床意義[3]。miR-19a在糖尿病誘導的心肌組織中過表達，可能參與糖尿病心肌損傷過程。Liu等[4]研究顯示，激活細胞因子信號轉導抑制蛋白3(SOCS3)可抑制蛋白質酪氨酸激酶-1(JAK1)及轉錄活化蛋白3(STAT3)磷酸化水平，抑制SOCS3表達可抑制肝癌細胞自噬。有研究顯示，I/R導致心肌細胞過度自噬，抑制I/R誘導的心肌細胞自噬，進而保護心臟功能[5]。miR-19能否參與調控缺氧(hypoxia，H)和復氧(reoxygenation，R)誘導的心肌細胞自噬過程及其與SOCS3/JAK1/STAT3通路的關系尚未明確。本研究在體外模擬H/R模型[6]，探討miR-19a過表達對H/R誘導下心肌細胞增殖、凋亡及自噬變化情況，并分析潛在的作用機制，為預防心肌細胞I/R損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗材料 大鼠心肌細胞H9c2(GNR5)購自中國科學院細胞庫；DMEM高糖(11995)/無糖(90113)培養基、優級胎牛血清(11011-8611)、胰蛋白酶消化液(0.25%)(T1350)、雙抗(青鏈霉素混合液)(P1400)、Matrigel基底膠(M8370)、逆轉錄試劑盒(T2210-200T)、電化學發光(ECL)液(PE0010)購自北京Solarbio公司；miR-19a模擬(mimics)、miR-19a陰性對照(negative control，NC)由廣州銳博生物科技有限公司設計；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒(C1062M)、RIPA裂解液(P0013B)、Trizol試劑盒(R0016)、細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(C0037)上海碧云天生物技術有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒(11668019)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate Dehydrogenase，GAPDH)兔抗人多克隆抗體(PA1-16777)、SOCS3兔抗人多克隆抗體(PA5-87485)、Beclin-1兔抗人多克隆抗體(PA5-96649)、微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ/Ⅰ(microtubule-associated protein light chain 3 Ⅱ/Ⅰ，LC3Ⅱ/Ⅰ)兔抗人多克隆抗體(PA5-109226)、核孔蛋白(nucleoporin 62，p62)兔抗人多克隆抗體(PA5-27247)、JAK1兔抗人多克隆抗體(PA5-105265)、JAK1磷酸化(p-JAK1)兔抗人多克隆抗體(44-4222G)、STAT3兔抗人多克隆抗體(710077)、STAT3磷酸化(p-STAT3)兔抗人多克隆抗體(44380G)、山羊抗兔IgG(H+L)二級抗體(A32731)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2 實驗儀器 二氧化碳細胞培養箱(BBD6220)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；低氧工作站(DY-S)購自黑龍江邁沃德工貿有限公司；聚合酶鏈式反應儀(T100)購自美國Bio-Rad公司；酶標儀(ST-360)購自上?？迫A生物工程股份有限公司；倒置顯微鏡購自(MA100N)購自日本Nikon；流式細胞儀(ZS-AE7S)購自中生(蘇州)醫療科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 心肌細胞培養 將H9c2心肌細胞用含10%胎牛血清(v/v)、1%雙抗(v/v)、89%高糖DMEM培養基(v/v)的培養瓶培養，置于37 ℃、5%CO2培養箱，每日更換1次新鮮培養液。細胞融合度>80%時進行傳代并保種，胰酶消化收集3～5代細胞用于后續實驗。

1.2.2 miR-19a mimics轉染 將處于對數期生長的H9c2心肌細胞接種于6孔板(5×105個/孔)，待細胞完全貼壁后，隨機分為3組：H/R組、H/R-miR-19a mimics組和H/R-miR-19a陰性對照(NC)組。H/R-miR-19a模擬(mimics)組、H/R-miR-19a NC組分別使用無血清的培養基稀釋miR-19a mimics儲存液、miR-19a NC儲存液及LipofectamineTM2000轉染液處理6 h，更換新鮮培養液培養細胞24 h，H/R組不進行轉染處理，收集各組細胞用于后續實驗。

1.2.3 H/R模型建立 按1.2.2步驟收集的各組細胞參照文獻[6]，換用等量低糖無血清DMEM培養基(已用CO2和N2充分飽和3 h)，孵育2 h(37 ℃)，置于低氧培養箱(37 ℃、1%O2、5%CO2、94%N2)中培養10 h，胰酶消化處理，收集各組細胞，加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，置于常氧培養箱(37 ℃、95%空氣、5%CO2)中復氧2 h。另按1.2.1收集的細胞，接種于6孔板上(5×105個/孔)，常規培養，設置為Control組。收集各組細胞用于后續實驗。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR) 使用Trizol試劑盒分別提取按1.2.3步驟收集的各組H9c2心肌細胞總RNA，取1 μg總RNA進行逆轉錄、PCR擴增反應。PCR反應條件：95 ℃預處理1 min，95 ℃ 15 s，70 ℃ 30 s，擴增40個循環。以U6為內參，應用2-△△Ct法計算miR-19a基因相對表達量。miR-19a及U6引物由上海生工生物工程有限公司設計合成，引物序列見表1。

表1 miR-19a和參考U6引物序列(5′-3′)

1.2.5 CCK-8實驗 將1.2.3收集的各組細胞分別重懸，接種于96孔細胞板(4.5×104個/孔)上，每組設置6個復孔，待細胞完全貼壁后，每孔添加100 μL CCK-8，避光孵育2.5 h，酶標儀檢測450 nm波長下各孔OD值，計算各組細胞生存率，取平均值。細胞生存率(%)=各實驗組OD值/各空白Control組OD值×100%。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 胰酶(不含EDTA)消化收集1.2.3各組細胞，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次，離心(1 000 r/min，5 min)，Binding Buffer重懸(500 μL)，依次添加10 μL Annexin V-FITC和PI，充分混勻，常溫避光靜置15 min，流式細胞儀檢測凋亡率。凋亡率(%)=凋亡早期細胞比例+凋亡晚期細胞比例。

1.2.7 蛋白免疫印跡法 收集1.2.3各組細胞，PBS清洗3次，每孔加入200 μL預冷的RIPA裂解液，提取各組總蛋白。加入等量蛋白樣品電泳，轉膜，PBS清洗，在37 ℃下用5%脫脂牛奶封閉4 h，加入一抗LC3Ⅱ/Ⅰ(1∶500)、p62、Beclin-1、SOCS3、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)，搖床孵化過夜，洗膜，添加二抗(1∶10 000)，室溫孵化2 h，洗膜，根據ECL說明書進行顯色曝光，凝膠成像儀成像。分析目標蛋白與GAPDH內參條帶比值。

2 結 果

2.1 各組H9c2心肌細胞中miR-19a表達比較 與Control組比較，H/R組H9c2心肌細胞miR-19a表達水平降低(P<0.05)；與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞miR-19a表達水平顯著升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組H9c2心肌細胞中miR-19a表達比較(±s，n=6)

2.2 miR-19a mimics轉染對H/R誘導的H9c2心肌細胞存活率的影響 與Control組比較，H/R組H9c2心肌細胞存活率降低(P<0.05)；與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞存活率升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 miR-19a mimics轉染對H/R誘導的H9c2心肌細胞存活率的影響(±s，n=6) 單位：%

2.3 miR-19a mimics轉染對H/R誘導的H9c2心肌細胞凋亡的影響 與Control組相比，H/R組H9c2心肌細胞凋亡率升高(P<0.05)；與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞凋亡率降低(P<0.05)。詳見圖1、表4。

圖1 miR-19a mimics轉染對H/R誘導的H9c2細胞凋亡的影響

表4 miR-19a mimics轉染對H/R誘導的H9c2心肌細胞凋亡的影響(±s，n=6) 單位：%

2.4 miR-19a mimics轉染對各組H9c2心肌細胞自噬標記物LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、p62表達的影響 與Control組比較，H/R組H9c2心肌細胞Beclin-1蛋白表達水平及LC3Ⅱ/Ⅰ升高(P<0.05)，p62蛋白表達水平降低(P<0.05)；與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞Beclin-1蛋白表達水平及LC3Ⅱ/Ⅰ降低(P<0.05)，p62蛋白表達水平升高(P<0.05)。詳見圖2、表5。

圖2 各組LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1和p62蛋白表達條帶圖(A為Control組；B為H/R組；C為H/R-miR-19a NC組；D為H/R-miR-19a mimics組)

2.5 miR-19a mimics轉染對H9c2心肌細胞SOCS3、p-JAK1、p-STAT3表達的影響 與Control組比較，H/R組H9c2心肌細胞SOCS3蛋白表達水平升高(P<0.05)，p-JAK1、p-STAT3水平降低(P<0.05)；與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞SOCS3蛋白表達水平降低(P<0.05)，p-JAK1、p-STAT3水平升高(P<0.05)。詳見圖3、表6。

圖3 各組H9c2心肌細胞SOCS3、p-JAK1、p-STAT3蛋白表達條帶圖(A為Control組；B為H/R組；C為H/R-miR-19a NC組；D為H/R-miR-19a mimics組)

3 討 論

心肌I/R損傷是一種病理性疾病，特征是血液供給受限，恢復灌注并伴隨供氧，最終導致急性心肌梗死或心力衰竭[7]。近年來，治療心肌I/R損傷手段取得重要進展，但療效需進一步提高。有研究顯示，H/R誘導大鼠H9c2心肌細胞損傷模型可一定程度模擬I/R損傷，因此，本研究選擇大鼠H9c2心肌細胞作為體外研究對象[8]。心肌I/R損傷機制尚未明確，尋找治療心肌I/R損傷的有效靶點，是減少I/R損傷的突破口。

I/R損傷可誘導心肌細胞凋亡，是導致I/R損傷病人生存率低的重要因素。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類單鏈非編碼RNA，研究證實，其與心肌細胞增殖、凋亡等密切相關[9]。Mao等[10]研究顯示，上調miR-19a-3p表達水平可減輕心肌肥大。Liu等[11]研究顯示，miR-19a-3p具有抑制心臟肥大和心力衰竭的能力。本研究首先構建了miR-19a過表達體系，之后建立H/R損傷模型，與Control組比較，H/R組H9c2心肌細胞miR-19a表達水平、存活率降低，凋亡率升高，提示H/R可誘導損傷H9c2心肌細胞，I/R損傷模型構建成功，推測miR-19a與H/R誘導的心肌細胞的增殖、凋亡相關。Gao等[12]研究顯示，miR-19a模擬物可增強心肌細胞增殖，減輕心肌梗死引起的心臟損害。本研究結果顯示，與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞miR-19a表達水平、細胞存活率升高，凋亡率降低，提示過表達miR-19a可抑制H/R誘導H9c2心肌細胞死亡及凋亡，推測miR-19a可能成為治療I/R損傷的潛在靶標。

自噬是細胞受外界刺激以維持穩態的動態過程。I/R過程中，心肌細胞自噬發揮著損傷作用。Beclin-1是細胞自噬過程的必需蛋白質，可促進自噬體形成[13]。LC3Ⅱ與溶酶體膜結合誘導細胞自噬，可作為自噬小體標記物之一，p62可用于測定自噬通量，其表達水平與自噬活性成反比[14]。本研究結果顯示，與Control組比較，H/R組H9c2心肌細胞Beclin-1蛋白表達水平及LC3Ⅱ/Ⅰ升高，p62蛋白表達水平降低，提示H/R誘導增強了心肌細胞自噬；與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞Beclin-1蛋白表達水平及LC3Ⅱ/Ⅰ降低，p62蛋白表達水平升高，提示miR-19a過表達可減輕H/R誘導的心肌細胞自噬，推測miR-19a可能通過抑制H/R誘導的心肌細胞自噬，發揮心肌保護作用。

Li等[15]研究顯示，miR-19a在系統性幼年關節炎病人中低表達，且能激活SOCS3/JAK/STAT信號通路。本研究結果顯示，與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較，H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞SOCS3蛋白表達水平降低，p-JAK1及p-STAT3水平升高，提示過表達miR-19a可抑制SOCS3表達，促進p-JAK1及p-STAT3表達。Liu等[4]研究顯示，抑制/促進SOCS3表達，可抑制肝癌細胞/促進乳腺癌細胞自噬的形成。因此推測，過表達miR-19a可能通過抑制SOCS3表達，促進p-JAK1/p-STAT3水平，抑制H/R誘導的心肌細胞自噬。

綜上所述，過表達miR-19a可能通過抑制SOCS3表達，激活JAK1/STAT3信號通路，抑制H/R誘導的心肌細胞自噬，從而減輕H/R誘導的心肌細胞損傷，為臨床制定治療I/R心肌損傷的新策略提供了參考。臨床導致I/R心肌損傷的因素復雜且具有不可控性，僅憑體外模擬實驗證據尚不充分，今后將聯合體內小鼠模型和臨床試驗，深入探討miR-19a對I/R心肌損傷的影響及作用機制。