F3代波雜山羊XKR4基因多態性與生長性狀的關聯分析

阮 涌，陳 祥，田貴剛，安冬偉，鄒啟順

（1高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室/貴州大學動物科學學院，貴州貴陽550025；2銅仁市萬山區動物疾病預防控制中心，貴州銅仁 554200；3務川自治縣宏牧羊業有限公司，貴州遵義 564300）

0 引言

【研究意義】貴州白山羊是我國肉用型優良地方山羊品種之一，具有性成熟早、繁殖力高、適應性強、板皮質優等特性（楊家大等，2016；張黔浪等，2016；王鑫等，2017），但也存在體型小、屠宰率低及生長速度慢等缺點（安清明等，2020）。為改善貴州白山羊生長性能，通過引進波爾山羊為父本雜交獲得F代，選擇其優秀個體為母本，以貴州白山羊為父本雜交獲得F代，再以貴州白山羊為父本雜交形成F代。因此，分析F代波雜山羊生長性能與生長性狀相關基因多態性的關聯性，可為后期培育出既改善貴州白山羊生長緩慢及體型小的缺點，又保留貴州白山羊優良肉品質的新品系提供科學數據，進而加快貴州白山羊新品系的育成。【前人研究進展】至今，有關山羊生長性能與生長性狀相關基因多態性的關聯分析已有較多研究報道（Nguyen et al.，2011；王璽年等，2013；姚毅等，2015a，2015b）。康建兵（2016）研究證實，瘦素基因（）G14651A位點與貴州白山羊成年羊的體重顯著相關，且GA基因型個體顯著高于GG基因型個體，管圍方面則是GA基因型和AA基因型個體顯著高于GG基因型個體；瘦素受體基因（）A71354G位點與貴州白山羊周歲羊胸圍顯著相關，且GG基因型個體的胸圍顯著高于AA基因型個體。田應志等（2017）在貴州白山羊生長性狀與肝臟型脂肪酸結合蛋白基因（）相關性的研究中發現，C4557T和A4575G位點多態座位有利于提高貴州白山羊體重、體高、體斜長和管圍，其中CCGG基因型有利于提高貴州白山羊成年母羊的體高和體斜長，TTGG基因型有利于提高貴州白山羊周歲母羊的體重和管圍。熊琪等（2017）在分析山羊肌醇磷酸酶基因（）與生長性狀的關聯性時發現，基因內含子2存在1個U/A突變的SNP位點，且該位點與初生重量、胸圍、管圍和體高等性狀顯著相關，等位基因C與生長呈正相關。Li等（2020）在研究基因拷貝變異數與山羊生長性狀的相關性時發現，基因拷貝數與貴州白山羊的生長性狀顯著相關。Shi等（2020）研究發現，山羊基因拷貝數變異對其體重、體長和體高的影響存在顯著相關，因此基因拷貝數可作為輔助山羊生長性狀選擇的分子標記。Xu 等（2020）通過研究基因與中國山羊群體生長性狀的相關性，發現貴州白山羊270型缺失個體的胸圍優于正常個體。【本研究切入點】基因是Kell血型系統相關亞單元家族（XKR）成員之一，在生物體內參與紅細胞膜功能、神經系統發育、細胞代謝、脂肪代謝及糖類代謝，并調控動物的生長和發育過程（Russo et al.，1998；吳周林，2015；趙克慧，2015），目前已有研究發現基因是兔生長性狀相關基因，可作為兔品種選育的重要分子標記（吳周林等，2016）。山羊作為重要的草食動物，與兔具有相同的食性，因此明確基因多態性與山羊生長性狀的相關性對指導生產具有重要意義。【擬解決的關鍵問題】以F代波雜山羊為研究對象，通過血液DNA混池測序的方法對基因SNP位點進行鑒定，并與F代波雜山羊的生長性狀進行關聯分析，旨在篩選出優異基因為后期培育新品系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

F代波雜山羊由務川縣宏牧羊業有限公司提供，選取統一飼養環境下的107只F代波雜山羊，通過頸靜脈采集5 mL血液置于EDTA抗凝管中。測量并記錄F代波雜山羊初生、6月齡和12月齡的體重、體高、體長、胸圍及管圍等生長數據。

1.2 試驗試劑及儀器設備

DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，2×PCR StarMix購自西寶生物科技（上海）股份有限公司，DM 2000 DNA Marker購自北京擎科生物技術有限公司。超微量分光光度計（Thermo Mano Drop 2000）和高速冷凍離心機（RC-6 Plus）購自美國Thermo公司，梯度PCR儀（9902）購自德國ABI公司，凝膠成像系統（Universal Hood II）購自美國Bio-Rad公司。

1.3 引物設計與合成

NCBI已公布的山羊基因（NC030821.1）全長313040 bp，包含3個外顯子區域。根據引物設計優化原則，采用Primer Premier 5.0設計覆蓋外顯子區域的PCR擴增引物（表1），委托北京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 F3代波雜山羊DNA提取及檢測

利用血液DNA提取試劑盒提取血液DNA，采用超微量分光光度計檢測DNA的純度和濃度，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，-20 ℃保存備用。

1.5 PCR擴增及測序

PCR 反應體系40.0 μL：2×PCR StarMix 20.0 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模板2.0 μL，ddHO 15.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃30 s，55～65 ℃1 min，72 ℃30 s，進行32個循環；72 ℃終延伸7 min。PCR擴增產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳進檢測。同時，對提取的107頭羊血液DNA混池（1.5 μL）進行PCR擴增，PCR擴增產物送至北京擎科生物科技有限公司測序，用DNAStar對測序結果與原始序列進行對比，篩選出SNP位點。

1.6 數據處理

采用Excel 2017計算SNP位點的等位基因頻率、基因型頻率、遺傳純合度（）、期望雜合度（）、有效等位基因數（）及多態信息含量（PIC）等，以卡方（χ）檢驗分析基因型是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態（周春寶等，2021），并利用SPSS 25.0分析不同基因型與生長性狀的關聯性。

2 結果與分析

2.1 SNP位點檢測結果

利用表1中的引物與DNA混池進行PCR擴增，PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳（圖1）后送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。測序結果表明，F代波雜山羊基因Exon-2擴增區域存在2個SNPs位點（圖2），分別是C194069A和T194091A，均屬于Intron-1區域。

2.2 F3代波雜山羊XKR4基因SNPs位點遺傳學分析結果

由表2可知，F代波雜山羊基因2個SNPs位點的PIC均處于中度多態水平。C194069A位點的等位基因頻率中C＞A，優勢基因型為CC型；T194091A位點的等位基因頻率中T＞A，優勢基因型為TT型。χ檢驗結果表明，C194069A和T194091A位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態（＞0.05）。

2.3 F3代波雜山羊XKR4基因SNP位點不同基因型與生長性狀的關聯性

運用SPSS 25.0對F代波雜山羊C194069A和T194091A位點各基因型在初生、3月齡、6月齡和12月齡時的體重、體高、體斜長、胸圍及管圍進行差異性分析。結果顯示：在初生（表3）群體中，T194091A位點AA基因型與其他基因型的體斜長存在顯著差異（＜0.05，下同）。在3月齡（表4）群體中，C194069A和T194091A位點各基因型的生長性狀指標間均無顯著差異（＞0.05，下同）。在6月齡（表5）群體中，C194069A和T194091A位點AA基因型的體重分別與相應位點的CC基因型和TT基因型存在顯著差異。在12月齡（表6）群體中，C194069A位點AA基因型在體重和胸圍方面均極顯著優于CC基因型（＜0.01，下同），在體高方面與CC基因型存在顯著差異；T194091A位點AA基因型的體重、體斜長分別與TT基因型呈顯著或極顯著差異。對不同時段的日增重進行分析，結果（表7）發現在0～6月齡和0～12月齡，C194069A和T194091A位點AA基因型的日增重與相應位點的CC基因型和TT基因型分別存在呈顯著或極顯著差異。綜上所述，基因C194069A位點AA基因型個體的生長性能優于CC基因型個體和CA基因型個體，T194091A位點AA基因型個體的生長性能也優于TT基因型個體。

3 討論

目前，與山羊生長性狀相關的基因已有較多研究報道。如基因與貴州白山羊的體重增長相關，且AB基因型在生長性狀上優于AA基因型和BB基因型（Cai et al.，2013）；基因多態性與貴州黑山羊的體重和體尺性狀相關（羅開鵬等，2014）；貴州本地山羊基因G127A突變位點的GA基因型在體斜長、胸圍和管圍方面顯著高于GG基因型和AA基因型（謝海強等，2014）。基因在生物體內廣泛參與細胞代謝、脂肪代謝及糖類代謝，進而調控機體的生長發育過程（吳周林，2015）。本研究的Hardy-Weinberg平衡檢驗結果表明，F代波雜山羊基因C194069A和T194091A位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態，其PIC處于中度多態性（0.25＜PIC＜0.50），可進行生長性狀的關聯分析，在山羊育種工作中有一定參考價值。

關于基因在畜禽育種中的應用已有相關研究報道。澳大利亞牛的肉和胴體性狀全基因組關聯性研究發現基因SNP位點與牛皮下脂肪厚度相關（Bolormaa et al.，2011）；在秈牛和雜交牛的研究中發現，基因SNP位點（rs41724387）表達與臀部脂肪厚度極顯著相關（Porto Neto et al.，2012）；基因與內洛爾牛的初生重和成年體重相關（Utsunomiya et al.，2013）；基因多態性與羊茅飼養肉牛的血清催乳素濃度顯著相關，推測基因在介導羊茅中毒的負面影響中發揮作用（Bastin et al.，2014）。此外，Lindholm等（2012）在研究基因上包含位置候選基因、和區域與牛采食和生長表型的相關性時發現，基因與牛群體的采食量和增重密切相關。可見，基因在動物脂肪沉積及肌肉生長等方面發揮重要作用，但至今鮮見與羊生產性能相關的研究報道。本研究通過直接測序發現在F代波雜山羊基因Intron-1區域存在2個SNPs位點，在6月齡和12月齡的F代波雜山羊群體中，C194069A位點的AA基因型與CC基因型在體重方面存在顯著或極顯著差異；T194091A位點AA基因型在初生群體中與TT基因型和TA基因型的體斜長存在顯著差異，在6月齡和12月齡群體中，AA基因型與TT基因型的體重存在顯著差異。此外，通過日增重分析發現這2個SNPs位點的AA基因型均優于其他基因型，提示基因C194069A和T194091A位點可應用于F代波雜山羊的后續育種工作。由于生長性狀受遺傳、性別和環境等因素的影響，因此今后可篩選更多基因進一步驗證，從而培育出F代波雜山羊優勢基因群體。

4 結論

F代波雜山羊基因存在2個SNPs位點（C194069A和T194091A），且均表現為AA基因型個體的生長性能優于其他基因型個體，即基因可作為F代波雜山羊生長性狀的候選基因。