視黃酸通過miR-210促進隱睪生精細胞增殖分化

陸峰 安妮妮 陳輝 何國慶 占雄 吳謀東 汪丹 王蔚 彭金普

隱睪癥是常見的先天性泌尿生殖系統畸形，在足月男嬰中的發病率高達3%～4%[1]。隱睪已成為男性不育的重要原因。早期睪丸固定術或激素治療能使隱睪睪丸降至陰囊內，但不能有效恢復患者的生精功能[2-3]。視黃酸(retinoic acid, RA)是維生素A在體內氧化代謝的一類具有生物活性的產物，具有維持雄性生殖系統發育和正常的作用[4]。研究證實，RA及其受體是精子發生的重要因素，缺乏維生素A的動物精子生成過程停止，大多數生殖細胞被降解，但RA治療可恢復生精過程[5]。近期研究證實，微小RNA(micro RNAs, miRNAs)在男性不育等相關疾病中發揮重要調控作用。例如，miR-4485-3p在特發性弱精子癥男性精子中低表達，并可能是線粒體功能障礙與弱精子癥的關鍵分子[6]。MiR-509-5p與男性不育呈負相關，在伴有成熟停滯的不育男性中低表達，可抑制睪丸生殖細胞腫瘤細胞體外增殖，并促進凋亡[7]。此外，有研究證實，RA可通過調控miRNA的表達影響疾病的發展進程[8-9]。本研究通過構建氟他胺致隱睪小鼠模型，探討RA對隱睪生精細胞增殖分化及對隱睪組織中miR-210表達的影響及機制。

材料與方法

一、主要試劑

氟他胺及RA購于美國Sigma公司。一步法逆轉錄試劑盒購于日本TaKaRa公司。RT-qPCR引物購于北京金唯智生物技術有限公司。Trizol試劑和RIPA裂解液購于南京KeyGEN公司。C-kit和PLZF一抗、HRP標記的二抗購于美國Abcam公司。

二、研究方法

1.隱睪小鼠模型構建及分組：所有BALB/c小鼠適應性喂養后將雌雄小鼠按2：1比例合籠，隨機分為：正常對照組(Control組)、氟他胺組(Flu組)、視黃酸治療組(RA組)、Flu+miR-210敲降組、Flu+miR-210過表達組及Flu+miR-210過表達+RA組，每組各10只。合籠后檢測陰栓，以觀察到陰栓之日為妊娠0 d。從妊娠后12～21 d每天給孕鼠灌胃，700 mg/kg。判斷標準：幼鼠出生后4周觀察幼鼠有無陰囊或睪丸是否下降至陰囊。在氟他胺組基礎上，將antagomiR-210和agomiR-210通過尾靜脈分別注射至幼鼠體內，8 mg/kg。

2. RT-qPCR實驗檢測miR-210、C-kit和PLZF mRNA的表達水平：使用Trizol試劑提取各組小鼠睪丸組織中的總RNA，使用一步法逆轉錄試劑盒將全部RNA逆轉錄成cDNA，隨后進行RT-qPCR檢測miR-210、C-kit和PLZF mRNA的表達水平。反應程序為：預變性95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s、45個循環。以U6和GAPDH為內參，采用2-△△Ct法定量。

3. Western blot檢測C-kit和PLZF蛋白的表達水平：使用RIPA裂解液提取各組小鼠睪丸組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。以30 μg/孔上樣量行10% SDS-PAGE電泳，半干法轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入1∶2 000稀釋好一抗，4℃過夜孵育；次日，棄一抗，加入1∶3 000稀釋的HRP標記的二抗，室溫孵育2 h；加入ECL化學發光液進行顯影，最后在凝膠成像儀上進行曝光拍照，Image J分析蛋白條帶灰度值。

結 果

一、RA促進隱睪生精細胞增殖分化

RT-qPCR和Western blot結果顯示，與Control組相比，Flu組睪丸組織中C-kit和PLZF mRNA和蛋白表達水平均顯著下調，RA治療后C-kit和PLZF mRNA和蛋白表達水平明顯恢復(圖1A和圖1B)。該結果說明，RA可促進隱睪生精細胞增殖分化。

**P<0.01, vs Control group; △△P<0.01, vs Flu group

二、RA下調隱睪睪丸組織中miR-210的表達

RT-qPCR結果顯示，與Control組相比，Flu組睪丸組織中miR-210表達水平顯著上調，而RA治療可回復氟他胺對miR-210的上調作用(圖2)。該結果說明，RA可下調隱睪睪丸組織中miR-210的表達水平。

**P<0.01, vs Control group; △P<0.05, vs Flu group

三、敲降miR-210促進隱睪生精細胞增殖分化

RT-qPCR結果顯示，與Flu組相比，敲降miR-210顯著下調隱睪睪丸組織中miR-210的表達水平(P<0.05，圖3A)。RT-qPCR和Western blot結果顯示，與Flu組相比較，敲降miR-210組顯著上調睪丸組織中C-kit和PLZF mRNA和蛋白表達水平(P<0.05，圖3B和圖3C)。該結果說明，敲降miR-210可促進隱睪生精細胞增殖分化。

**P<0.01, vs Flu group

四、RA下調miR-210促進隱睪生精細胞增殖分化

RT-qPCR結果顯示，與Flu組相比，過表達miR-210組顯著上調睪丸組織中miR-210的表達水平，而過表達miR-210同時用RA治療，可回復miR-210的表達水平(圖4A)。RT-qPCR和Western blot結果顯示，miR-210過表達組睪丸組織中C-kit和PLZF mRNA和蛋白表達水平均顯著低于Flu組(P<0.05)，而RA治療可回復睪丸組織中C-kit和PLZF mRNA和蛋白表達水平，即RA治療可回復過表達miR-210對隱睪生精細胞增殖分化的抑制作用(圖4B和C)。該結果說明，RA可下調miR-210促進隱睪生精細胞增殖分化。

**P<0.01, vs Flu group; △P<0.05, △△P<0.01, vs Flu + agomiR-210 group

討 論

精原干細胞的分裂呈現為邊復制邊分化的不對稱性，這是雄性哺乳動物能夠連續不斷進行生精過程的基礎[10]。而 PLZF和C-kit是精原干細胞增殖分化的關鍵基因[11-12]。研究表明，PLZF參與精原干細胞的自我復制過程，是維持精原干細胞數目不可或缺的因子[13]。本研究發現，隱睪睪丸組織(氟他胺組)中PLZF mRNA和蛋白的表達水平均明顯下降，表明隱睪小鼠精原細胞的自我增殖發生異常，精原細胞數量減少。而使用RA治療后，RA組中PLZF mRNA和蛋白的表達水平較氟他胺組顯著上調，這說明RA可促進精原細胞的自我增殖，維持精原細胞數量。C-kit即跨膜酪氨酸激酶受體，在精原細胞分化過程中起著重要作用[14]。近期研究表明，C-kit通過與其配體干細胞因子(stem cell factor,SCF)結合，可促使精原細胞進行DNA合成，在一定程度上反應了精原細胞分化活動的強弱，是精原細胞分化的標志之一[15]。本研究發現，C-kit在隱睪睪丸組織中表達水平顯著下調，RA治療明顯恢復其表達水平。這反映出隱睪精原細胞分化出現障礙，而RA能上調C-kit的表達，促進精原細胞分化。

MiRNAs是一類長約22 nt的單鏈非編碼小RNA，在機體生理和病理過程發揮重要調控作用[16]。研究表明，miRNAs在包括隱睪在內的多種男性不育疾病中異常表達[17]。例如，miR-34c在隱睪患者睪丸組織和隱睪小鼠模型中均顯著下調，其異常表達破壞了精原干細胞的自我更新和分化平衡，最終破壞了隱睪精子的產生[18]。Moritoki等人[19]研究證實，miR-135a-5p在隱睪中低表達，并通過與叉頭框蛋白O1重組蛋白(Forkhead box transcription factor O1,FOXO1)相互作用參與精原干細胞的維持。本研究發現，miR-210在隱睪睪丸組織中高表達，而RA治療可下調其表達水平。在隱睪小鼠體內穩定表達miR-210拮抗劑antagomiR-210后,PLZF和C-kit mRNA和蛋白的表達水平均顯著上調，穩定表達agomiR-210后，PLZF和C-kit mRNA和蛋白的表達水平均明顯低于氟他胺組，而穩定表達agomiR-210后，再進行RA治療則可恢復PLZF和C-kit的表達水平。這說明，高水平的miR-210能引起精原細胞增殖和分化異常，而RA治療可下調隱睪睪丸組織中miR-210的表達，促進PLZF和C-kit的表達。

綜上所述，miR-210在隱睪睪丸組織中高表達，RA可下調miR-210的表達，并通過miR-210促進隱睪生精細胞的增殖和分化。