202例急性淋巴細胞白血病兒童細胞遺傳學特點

尹萌萌 劉愛國 張艾 王雅琴 胡群

急性淋巴細胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)為兒童時期常見的血液腫瘤疾病，在過去的十年中，分子生物學及細胞遺傳學的大力發展使人們發現更多有關白血病的染色體核型及基因，增強了人們對白血病的生物學認識，包括發病機制、診斷及預后等，促進了臨床對患兒的精確個體化治療[1]。以往研究證實ALL兒童攜帶的染色體核型及融合基因，可作為白血病診斷和預測疾病進展的生物標志物[2]，但其在病人群體的分布特點，以及與患兒臨床特征的相關性，還有待進一步研究。因此，本次研究對202例ALL兒童的細胞遺傳學特點進行研究，分析其與臨床特征的相關性。

對象與方法

1.研究對象

本科室2009～2015年診斷的202例ALL兒童，隨訪至2018年底，中位隨訪時間為5.9年。將本組ALL患兒分成3個年齡組：① 年齡≤1歲，②1歲<年齡≤6歲，③年齡>6歲。收集患兒細胞遺傳學結果及臨床資料，包括性別、年齡、臨床危險度及預后等。

2.ALL診斷及臨床危險度分型標準

ALL診斷標準：骨髓涂片中，淋巴系細胞增殖異常，原始+幼稚淋巴細胞≥30%骨髓有核細胞，即可診斷ALL。

臨床危險度分型標準：(1)低危ALL(low risk-ALL，LR-ALL)：不具有中危及高危因素。(2)中危ALL(intermediate risk-ALL，IR-ALL)：具有以下1項或多項者：①年齡≥10歲；②初診時白細胞≥50×109/L；③中樞神經系統白血??；④T-ALL；⑤染色體數<45，或除t(12；21)、t(9；22)以外的異常染色體核型，或除t(4；11)以外的MLL基因重排。(3)高危ALL(high risk-ALL，HR-ALL)：具有以下1項或多項者：①年齡<12個月；②初診時白細胞≥100×109/L；③有t(9；22)染色體核型(BCR-ABL1融合基因)或t(4；11)染色體核型(MLL-F4融合基因)；④誘導緩解治療效果不佳。

3.檢測方法

(1)染色體核型：取骨髓細胞，采取R顯帶法后，顯微鏡下觀察中期分裂相細胞染色體核型，核型定義參照《人類細胞遺傳學國際命名法體制(ISCN)1995》。

(2)免疫分型：選擇免疫熒光法和流式細胞術，采用的單克隆抗體包括：T-ALL系：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8及TdT等。B-ALL系：CD10、CD19、CD20、CD23、及SmIg等。髓系：CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD117及cMPO等。

(3)融合基因：取患兒骨髓細胞，選擇熒光原位雜交技術(FISH)或逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測融合基因。

4.治療方案及預后分組

本組患兒均按照中華兒科雜志兒童急性淋巴細胞性白血病診療建議(第三次修訂草案)治療[3]，異常染色體包括：超二倍體：染色體數目>46；亞二倍體：染色體數目<46。假二倍體：染色體數目為46條，存在結構異常者。

根據文獻報告的染色體與預后關系將患兒進行分組[4,5]：

①預后良好組：超二倍體，t(12；21)及正常核型；

②預后中等組：t(1；19)，假二倍體及其它簡單結構異常核型；

③預后差組：t(9；22),t(4；11)及亞二倍體。

5.統計學方法：

采用SPSS19.0統計軟件分析數據，分類資料以百分比表示，并采用卡方檢驗進行組內比較。Kaplan-Meier法評估患兒生存狀態及繪制生存曲線，各組生存率采用Log-rank檢驗比較，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1.基本情況

202例ALL患兒中，男性 136例，女性 66例，男女比例為2.1:1?；純耗挲g0.6～16歲，中位年齡為 5.4歲。

2.ALL兒童細胞遺傳學特點

本組患兒中，正常核型占67.8%(137/202)，異常核型占32.2%(65/202)，其中單純數目異常者占21.5%(14/65)，單純結構異常者占35.4%(23/65)，數目及結構均異常者占43.1%(28/65)。

本組患兒中，超二倍體占46.2%(30/65)，假二倍體占38.5%(25/65)，亞二倍體占15.3%(10/65)。異常結構核型中，t(9；22)占9.8%(5/51)，t(1；19)占9.8%(5/51)，t(4；11)占3.9%(2/51)，t(12；21)占2%(1/51)，t(6；19)占3.9%(2/51)，t(3；17)占3.9%(2/51)，t(12；22)占2%(1/51)，t(6；12)占3.9%(2/51)及其它改變核型占60.8%(31/51)，見圖1。

圖1 不同類型染色體核型構成比例

融合基因陽性占20.8%(42/202)。42例融合基因中，TEL/AML1占42.9%(18/42)，BCR/ABL1占23.8%，(10/42)，E2A/PBX1占23.8%(10/42)，SIL/TAL1占9.5%(4/42)，見圖2。

圖2 ALL兒童融合基因構成比例

3.各年齡組ALL兒童細胞遺傳學特點

本組患兒中，年齡≤1歲僅1例，1歲<年齡≤6歲共127例，年齡>6歲共74例。三組患兒的細胞遺傳學資料比較后發現，1歲<年齡≤6歲組患兒的異常染色體(37%vs23%，P=0.039)及超二倍體比例(18.9%vs8.1%，P=0.038)高于年齡>6歲組患兒，但BCR/ABL1比例較低(2.4%vs9.5%，P=0.026)，見表1。

表1 不同年齡組ALL兒童細胞遺傳學資料，n(%)

4.不同性別ALL兒童細胞遺傳學特點

不同性別患兒之間的異常核型發生率無明顯差別(29.4%vs37.9%，P=0.227)，不同類型染色體及融合基因間分布無明顯差別(均P>0.05)，見表2。

表2 不同性別ALL兒童細胞遺傳學資料，n(%)

5.不同臨床危險度ALL兒童染色體核型特點：

本組患兒中，LR 占25.7%(52/202)，IR 占32.2%(65/202)，HR占39.6%(80/202)，未知占2.5%(5/202)。不同臨床危險度患兒的細胞遺傳學資料見表3，HR組中異常核型(42.5%vs40%vs9.6%，P<0.001)、亞二倍體(8.6%vs4.6%vs0%，P<0.001)及假二倍體比例明顯高于另外兩組患兒(22.6%vs9.2%vs1.9%，P<0.001)，IR組中超二倍體比例明顯高于另外兩組患兒(26.2%vs11.3%vs7.7%，P<0.001)。

表3 不同臨床危險度ALL兒童細胞遺傳學資料，n(%)

6.融合基因與相應染色體核型比較

本組18例TEL/AML1陽性患兒中，超二倍體5例，亞二倍體1例，而t(12；21)僅有1例(5.6，1/18)。

10例BCR/ABL1陽性患兒中，檢測出t(9；22)占50%(5/10)。攜帶t(9；22) 的患兒多伴有其它異常染色體結構，如-7/del(7p)，9p異常，del(11p)，del(9)，dup(1q)和亞二倍體。

10例E2A/PBX1陽性患兒中，測出t(1；19)占50%(5/10)，假二倍體3例，超二倍體2例，亞二倍體1例。

本組患兒未測出MLL基因，但測出2例患兒t(4；11)陽性。同時，4例SIL/TAL1患兒中，未發現6q雜合性缺失、del(1q32)等異常結構染色體核型。

42例融合基因陽性患兒中，26.2%(11/42)患兒攜帶對應的染色體核型。

7.臨床預后分析

截止隨訪時間，存活166例(82.2%，166/202)，死亡22例(10.9%，22/202)，失訪14例(6.9%，14/202)。統計不同染色體預后組的生存時間制作生存曲線，見圖3。對本組患兒從ALL診斷時間(2009—2015年)開始隨訪，隨訪至2018.12.31，中位隨訪時間為5.9年。使用Log-rank檢驗比較三組患兒生存時間，具有明顯統計學差異(P<0.001)。

圖3 三組不同染色體核型ALL患兒生存曲線比較

討論

隨著對ALL生物異質性認識的提高和生物檢測技術的發展，ALL兒童的細胞遺傳學特點得到了越來越多的關注。其中，染色體及基因與疾病進展、治療及預后的相關性，已得到國際認可。文獻中報道，ALL兒童的細胞遺傳學改變發生率約為30%～50%[6]，本組ALL兒童的染色體異常發生率為32.2%，基因突變率為20.8%，低于以往研究報道，可能是由于本組患兒診斷時間跨度較大，早期技術不成熟，而導致假陰性偏高。

染色體核型異?？杀憩F在數目和/或結構改變。本組患兒中，數目及結構均異常者最多見(43.1%)。在異常遺傳學結果中，代表預后良好的超二倍體(46.2%)及TEL/AML1(42.9%)最多見，證明ALL兒童總體預后較好。

1.不同融合基因檢測及臨床特點

BCR-ABL1重排(Ph+)對應的染色體易位為t(9；22)，40%～85%的t(9；22) 易位患兒同時伴有其它結構異常[7]，但同時存在的異常結構對預后的具體影響還尚無定論，有文獻認為同時伴有-7/del(7p)或9p異常的預后更差，而伴隨超二倍體者可改善預后[8]。本組中，5例患兒伴有t(9；22)易位，合并的異常核型分別為del(11p)，dup(1q)，del(9)，-7/del(7p)和亞二倍體，與上述文獻報道有差異。如今，酪氨酸激酶小分子抑制劑的靶向治療可顯著改善此類患兒預后[9]。本組病例中，BCR/ABL1基因陽性的患兒中僅一半患兒檢測出t(9；22)，可能是由于未觀察到分裂中期骨髓細胞，或是檢測技術不成熟導致[10]。

t(1；19)易位合并E2A-PBXl融合是兒童ALL中常見的染色體易位之一，伴t(1；19)異常的患兒，初診時多有腫瘤浸潤及高白細胞血癥，預后欠佳，但近幾十年來，早期高強度的化療已改善t(1；19)患兒的預后[11]。本組患兒中，10例E2A/PBX1患兒僅測出5例t(1；19)，仍低于基因檢測陽性率。t(12；21)易位導致ETV6-RUNX1(TEL-AML1)基因融合，此類患兒預后較好[1]。與TEL基因有關的染色體易位包括t(9；12)，t(12；22)和t(12；21)，最常見的是t(12；21)，發生于25%的B-ALL兒童中，但由于此易位位置隱蔽，常規染色體檢查陽性率<1%，因此需結合FISH技術提高陽性檢測率[10]，本組僅檢測出1例t(12；21)。

MLL基因中11q23重排各亞型因染色體易位不同具有明顯的臨床異質性，但此類患兒預后均欠佳，造血干細胞移植也無法顯著改善其預后[12]。MLL基因中最常見的染色體改變為t(4；11)(q21；q23)，此易位常伴有其它核型異常，特別是i(7)(q10)和+6，但并不進一步影響患兒的預后。11q23易位常見的斷裂位點包括4q21，9p22，lp32，和19p13等[13]。本組患兒中，僅有1例嬰兒，攜帶的染色體為t(4；11)，但與其它基因陽性的患兒相反，未檢測到MLL基因。可能在有關t(4；11)易位檢測中，染色體改變比基因突變更易發現。

有文獻表明，部分T-ALL兒童可攜帶SIL-TAL1基因，同時合并染色體6q雜合性缺失及del(1q32)，此類患兒易發生高乳酸血癥，但該融合基因對ALL的預后影響還未確定[14]。本次研究中，T-ALL患兒共20例，其中SIL-TAL1基因陽性4例，未發現6q雜合性缺失，del(1q32)等異常結構染色體核型，可能是受T-ALL病例數偏少影響。

在本組ALL兒童細胞遺傳學檢測中，42例陽性融合基因僅發現11例對應的染色體核型，一方面由于檢測技術，一方面由于染色體核型改變的隱蔽性，但也存在2例t(4；11)易位患兒未發現MLL基因，說明在臨床中，不僅存在融合基因檢測陽性率高于染色體分析的現象，也說明ALL診斷準確性的提高，需要結合多種細胞遺傳學方法綜合判斷。

2.不同臨床特征ALL患兒細胞遺傳學

了解了本組ALL兒童總體細胞遺傳學改變特點后，根據患兒的不同臨床特征分組，進一步具體分析不同組患兒中的細胞遺傳學改變及分布特點。在臨床中，可觀察到ALL兒童的預后與年齡具有明顯的相關性，如在治療效果中，學齡前期及學齡期患兒優于嬰兒期及青春期患兒。除了個人體質、藥物耐受性及醫囑依從性的差異外，染色體及基因在不同年齡段患兒中是否也存在分布差別，需要我們比較分析。通過比較后發現，1歲<年齡≤6歲組患兒的異常染色體及超二倍體的分布比例高于年齡>6歲組患兒，而BCR/ABL1分布比例較低。本次分析結果不僅幫助臨床更好了解細胞遺傳學在不同年齡患兒中的分布差異，也進一步解釋了學齡前期及學齡期患兒預后較好的原因。在不同性別患兒中，異常染色體及不同類型細胞遺傳學結果分布均無差別，說明在ALL兒童中，男性與女性患兒的預后無明顯差異，性別不能作為預后預測指標，同時在治療方面也不需區別化療。

ALL兒童的臨床分型不僅取決于個人臨床特征，也取決于某些特定的染色體及基因。但攜帶某些特定染色體及基因的患兒，大多同時合并其它異常染色體核型，因此我們分析了不同臨床危險度患兒的染色體核型特點，經過比較后發現，HR組中異常核型、亞二倍體及假二倍體比例明顯高于另外兩組患兒，說明HR組患兒多同時合并預后不良的核型，但IR組中超二倍體比例高于另外兩組患兒，一方面是由于HR組患兒中，預后良好的染色體核型偏少，另一方面是由于LR組患兒中，正常核型占有大部分。

本研究不僅發現染色體及基因在不同臨床特征ALL兒童中的分布特點，也進一步證實了染色體與ALL預后的相關性，不僅強調了細胞遺傳學在臨床中的作用，也為我們在判斷ALL兒童預后時，提供了指導性意見。