枸杞中黃酮類(lèi)化合物降糖活性研究

張文艷，林宇琪，劉宏瑩，張 偉

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132101)

0 引言

枸杞是茄科枸杞屬植物，為明亮的橙紅色橢球漿果，屬傳統(tǒng)名貴藥材。中醫(yī)認(rèn)為它有補(bǔ)腎、明目、潤(rùn)肺的功效，用于肝腎不足所致的頭暈?zāi)垦！⒁暳p退、消渴等證，且療效確切顯著，故有“紅寶”之稱(chēng)[1-2]。糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前臨床上用來(lái)治療糖尿病的藥物主要有胰島素及化學(xué)藥物，但磺脲類(lèi)藥物容易發(fā)生低血糖及體重增加，個(gè)別病人會(huì)出現(xiàn)皮膚過(guò)敏反應(yīng)、白細(xì)胞減少等；二甲雙胍胃腸道反應(yīng)多見(jiàn)，長(zhǎng)期應(yīng)用可能會(huì)影響維生素B12的吸收；胰島素增敏劑起效較慢，可導(dǎo)致水鈉潴留，引起水腫及體重稍增，增加心衰風(fēng)險(xiǎn)及心功能3級(jí)以上禁用等,都存在著副作用[3]?；诖?，對(duì)于天然保健品的研究成為一種趨勢(shì)。為開(kāi)發(fā)藥食同源的枸杞，探索了枸杞不同組分降糖活性，針對(duì)糖尿病進(jìn)行安全有效的治療，為枸杞資源的綜合利用及開(kāi)發(fā)治療糖尿病的藥物和功能性食品提供了參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥材

枸杞為2018年9月份成熟的寧夏枸杞，為茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)枸杞(Lyciumbarbarum)的果實(shí)。

1.2 動(dòng)物

健康昆明種小鼠55只，雌雄各半，體重20±2 g，購(gòu)于長(zhǎng)生生物制品有限公司。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，每籠10只，喂以普通飼料，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境保持在室溫20℃～25℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.3 儀器與試劑

UV759CRT型紫外分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn))，血糖儀安穩(wěn)免調(diào)碼型(三諾生物傳感股份有限公司生產(chǎn))，三諾安穩(wěn)血糖試條(三諾生物傳感股份有限公司生產(chǎn))，四氧嘧啶(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)C10317497)，鹽酸二甲雙胍腸溶片(貴州天安藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20190420)，蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，批號(hào)100081-200406)，其他所用試劑皆為分析純。

2 方法

2.1 試驗(yàn)前處理

將枸杞放置于鼓風(fēng)干燥箱中55℃下干燥。將烘干后的枸杞粉碎，過(guò)20目篩，裝入密封袋中，放入冰箱備用。

2.2 枸杞有效成分的提取

精確稱(chēng)量枸杞1 000 g，加入適量體積為30%、60%、90%的乙醇，在超聲功率100 W、提取溫度為50℃的條件下超聲輔助提取30 min，提取3次，合并濾液，將總提取液濃縮至無(wú)醇味。

2.3 枸杞黃酮類(lèi)化合物的分離

取一定量的D101大孔樹(shù)脂對(duì)有效成分進(jìn)行分離純化，枸杞總提取液通過(guò)大孔樹(shù)脂吸附，依次使用蒸餾水、60%乙醇和80%的乙醇進(jìn)行洗脫。60%的乙醇洗脫液濃縮至無(wú)醇味，定容至500 mL，置于冰箱備用。

2.4 枸杞黃酮含量測(cè)定方法

2.4.1 對(duì)照品溶液制備

稱(chēng)取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，配成濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL濃度0.2 mg/mL蘆丁溶液置于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min；再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻后靜置6 min；加4 mL 4% NaOH溶液，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度(C)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，計(jì)算回歸方程[4]。

2.4.3 黃酮含量測(cè)定

精密吸取60%乙醇洗脫液1.0 mL于50 mL容量瓶中，加入60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。精確吸取稀釋洗脫液1 mL，置于25 mL容量瓶中，按照上述方法在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度平行3次，代入回歸方程計(jì)算樣品中黃酮含量。

2.5 降血糖動(dòng)物試驗(yàn)

2.5.1 糖尿病小鼠模型的建立

本試驗(yàn)采用四氧嘧啶誘發(fā)糖尿病動(dòng)物模型方法，用滅菌生理鹽水將四氧嘧啶配制成10 mg/mL的溶液，正常小鼠購(gòu)買(mǎi)后，所有動(dòng)物自由飲水、食。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后(測(cè)空腹血糖，作為該批小鼠的基礎(chǔ)血糖值)，除空白對(duì)照小組小鼠5只外，其余禁食不禁水15 h后，腹腔注射新鮮配制的四氧嘧啶160 mg/kg，72 h后對(duì)禁食不禁水4 h的小鼠尾靜脈取血，使用血糖儀檢測(cè)血糖濃度，選取血糖≥16.7 mmol/L者用于實(shí)驗(yàn)[5]。

2.5.2 實(shí)驗(yàn)小鼠的分組與給藥

在未進(jìn)行建模的正常空白對(duì)照組小鼠中隨機(jī)選取5只作為空白組，并將建模成功的小鼠隨機(jī)分為11組，每組5只，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、藥物A1、A2、A3(黃酮低、中、高劑量組)。各組給藥劑量如下：空白組、模型組灌胃等劑量生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃鹽酸二甲雙胍200 mg/kg，藥物A1、A2、A3為灌胃黃酮25.8、51.6、103.2 mg/kg，連續(xù)灌胃20 d。

2.6 測(cè)定指標(biāo)

2.6.1 體重

每天定時(shí)給藥，共給20 d，間隔5 d稱(chēng)量每只小鼠的體重并記錄(0 d、5 d、10 d、15 d、20 d)，觀察各組小鼠體重增減情況。

2.6.2 空腹血糖

每天定時(shí)給藥，共給20 d，間隔5 d尾靜脈取血一次，用血糖儀檢測(cè)空腹血糖(0 d、5 d、10 d、15 d、20 d)。檢測(cè)之前，小鼠更換墊料，稱(chēng)重并禁食不禁水12 h。在第20 d測(cè)完血糖后按下式計(jì)算降糖率：

2.6.3 糖耐量

末次給藥后，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)，小鼠空腹6 h后，按小鼠體重腹腔注射新鮮配制的200 mg/mL葡萄糖溶液2 g/kg，尾靜脈取血，用血糖儀測(cè)定注射葡萄糖后0、30、60和120 min時(shí)間點(diǎn)的血糖值。血糖值結(jié)果用 mmol/L表示，計(jì)算曲線(xiàn)下面積(AUC)，比較各組的葡萄糖耐量水平。血糖曲線(xiàn)下面積S(mmol/L)=(a+2b+3c+4d)/4，其中a、b、c、d分別為灌胃葡萄糖溶液0、30、60、120 min后的血糖值[6]。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果與分析

3.1 枸杞黃酮含量測(cè)定結(jié)果

按照枸杞黃酮含量測(cè)定方法得出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=8.858 6x+0.004 7，R2=0.999 2(y為吸光度，x為黃酮濃度)。以此測(cè)定黃酮的含量，得出枸杞黃酮的含量為1.72 mg/g。

3.2 枸杞中黃酮類(lèi)化合物對(duì)糖尿病小鼠體重的影響

從表1可以看出，小鼠體重在22.19～41.14 g，空白組的小鼠在正常進(jìn)食的情況下體重隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，模型組小鼠因在高血糖的影響下進(jìn)食、進(jìn)水量增加，但體重隨著時(shí)間變化體重呈現(xiàn)遞減；陽(yáng)性對(duì)照組在高血糖的影響下，但是在鹽酸二甲雙胍片的作用下體重變化不明顯；A1組小鼠體重隨著時(shí)間變化均呈下降趨勢(shì)；A2、A3小鼠的體重在給藥過(guò)程中體重先增加后減少，小鼠的體重有所下降或下降到正常值。

表1 枸杞不同組分對(duì)糖尿病小鼠體重的影響

3.3 枸杞中黃酮類(lèi)化合物對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響

根據(jù)表2可以看出，空白組小鼠因未得糖尿病所以空腹血糖沒(méi)有變化；模型組小鼠因沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行治療，其空腹血糖值持續(xù)增高；陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的血糖有著明顯的降低糖尿病小鼠空腹血糖值，平均降糖率為47.17%；A1、A2、A3組小鼠均有降血糖的趨勢(shì)，但隨著濃度的增加小鼠降血糖效果越明顯。

表2 枸杞不同組分對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響

3.4 枸杞中黃酮類(lèi)化合物對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響

由從表3可以看出，各組小鼠的血糖值均在30 min時(shí)達(dá)到最高峰，30 min后，黃酮類(lèi)化合物能不同程度地降低葡萄糖負(fù)荷后糖尿病小鼠的血糖值。各組與空白組相比較而言，0 min時(shí)A1、A3組小鼠均呈極顯著差異(P<0.01)，30 min時(shí)藥物組都呈極顯著差異(P<0.01)，60 min時(shí)陽(yáng)性對(duì)照組、B3組與空白對(duì)照組成極顯著差異，120 min時(shí)A3均成極顯著差異(P<0.01)；與模型組相比較，0 min時(shí)陽(yáng)性對(duì)照、A2組呈顯著差異(P<0.05)，30 min時(shí)A2組成極顯著差異(P<0.01)，與陽(yáng)性對(duì)照、A3組呈顯著差異(P<0.05)，60 min時(shí)陽(yáng)性對(duì)照、A1、A2組呈極顯著差異，120 min時(shí)陽(yáng)性對(duì)照、A、A2呈極顯著差異(P<0.01)；從曲線(xiàn)下面積(AUC)來(lái)看陽(yáng)性對(duì)照、A1均與空白組、模型組呈極顯著差異(P<0.01)，A3與空白組呈極顯著差異，A3組與模型組呈顯著差異(P<0.05)。

表3 枸杞不同組分對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響

4 結(jié)論

四氧嘧啶是自由基激活劑，可使胰島中超氧陰離子及過(guò)氧化氫等自由基濃度增高，致細(xì)胞損傷壞死，引起胰島素的合成分泌障礙，進(jìn)而引發(fā)糖尿病[11]。

采用四氧嘧啶造模方法，綜合考察了枸杞多糖、黃酮、總生物堿的降糖效果并將其進(jìn)行了對(duì)比，為枸杞資源的綜合利用及開(kāi)發(fā)治療糖尿病藥物和功能性食品提供了參考依據(jù)。但具體的降糖效果及枸杞降糖活性組分作用機(jī)理及有效成分有待進(jìn)一步研究。