HPLC法同時測定冠心生脈丸中5種成分的研究

葛 蕾，鄭 輝，張文濤，趙 銳

(淄博市食品藥品檢驗研究院，山東 淄博 255086)

0 引言

冠心生脈丸由中醫古方“生脈飲”加味而成，是純中藥制劑，主要以人參、五味子、丹參、赤芍等組方，諸藥合用可以益心氣、活心血、通心絡，對于冠心病、心絞痛、心律不齊等疾病具有良好的治療作用[1]。五味子有斂汗生津的功效，其主要成分為五味子醇甲。丹參能化瘀止痛，活血通脈，有效成分主要是丹參素鈉、丹參酮ⅡA和丹酚酸B。赤芍有活血化瘀、增強祛瘀止痛之功，主要是芍藥苷發揮作用。故此，測定主要有效成分含量對控制產品質量至關重要，也是藥品能發揮功效的重要依據。

現行質量標準中無含量測定項，通過查詢文獻發現，以往研究中，有對冠心生脈丸中芍藥苷、丹參酮ⅡA和丹參素含量測定的報道[2-4]，但未查詢到對五味子醇甲和丹酚酸B含量的測定文章，也未見丹參素鈉、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍藥苷同時測定的方法研究。為了全面監控藥品質量，使檢驗效率更高、結果更準確，使用HPLC-DAD法，建立了同時測定5種成分的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀Agilent 1260型，DAD檢測器(美國安捷倫公司生產)。電子分析天平ML204型，感量0.1 mg；MS205DU型，感量0.01 mg(均為瑞士梅特勒-托利多公司生產)。高純水儀IQ 7000型(美國密理博公司生產)。超聲波清洗器KQ-300GVDV型(寧波科生儀器廠生產)。冠心生脈丸樣品(批號分別為20210406、20210410、20210608)均為市售。芍藥苷(批號110736-202145，含量94.6%)、五味子醇甲(批號110857-201815，含量99.7%)、丹參酮ⅡA(批號110766-202022，含量98.9%)、丹酚酸B(批號111562-201917含量96.6%)、丹參素鈉(批號110855-201915 含量97.8%)(均為中國食品藥品檢定研究院生產)。甲醇、乙腈均為色譜級(美國默克生產)。磷酸優級(國藥集團生產)。

1.2 溶液的配制

對照品單標溶液：精密稱取芍藥苷10.34 mg、五味子醇甲9.60 mg、丹參酮ⅡA10.55 mg、丹酚酸B44.16 mg和丹參素鈉41.28 mg。準備25 mL量瓶，分別置于其中，溶解定容使用50%甲醇水溶液。

混標溶液：分別精準量取單標液適量，預備10 mL量瓶，全部放置其中，定容使用50%甲醇水溶液，得到丹參素鈉、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍藥苷分別為100.92、8.35、5.74、117.31和29.34 μg/mL的混標溶液。

樣品溶液：取樣品5袋，搗碎研細，精密稱取1 g置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲60 min，取出放涼，定容使用甲醇，用有機濾膜(0.45 μm)過濾即得。

陰性樣品溶液：按藥品制備方法制備缺丹參、赤芍、五味子的陰性樣品，按樣品溶液制備方法操作，即得。

1.3 色譜條件

色譜柱Agilent Eclipse Plus C18(5 μm；4.6×250 mm)。檢測器為DAD檢測器。流動相0.1%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫0～2 min，流動相A92%，2～10 min，流動相A92%→75%，10～30 min，流動相A75%→10%，流速2.0 mL/min。柱溫35℃，進樣量20 μL。此色譜條件下，鄰峰分離度均大于30，色譜峰的理論板數均大于5 000，陰性樣品對檢驗結果無干擾。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

所測5種成分紫外最大吸收波長各不相同，如果采用單一波長會出現某種成分峰面積較小、測量不準確的情況。通過查閱相關文獻[5-9]，在200～400 nm用DAD檢測器進行全波長掃描，確定了5種成分紫外最大吸收波長。根據樣品中5種化合物的含量，綜合考量峰面積大小、檢測精度、操作方便，計算簡單等因素，確定在230 nm波長處測定丹酚酸B、芍藥苷和五味子醇甲的含量，丹參素鈉含量測定采用286 nm波長，丹參酮ⅡA含量的測定采用270 nm波長。

2.2 流動相和流速的選擇

采用等度洗脫很難將4種成分與其他復雜成分分離開，因此建立一種梯度洗脫方法[10-12]。分別考察了乙腈和甲醇與水、0.05%磷酸溶液、0.1%磷酸溶液的多種組合，結果乙腈-0.1%磷酸為流動相效果最好，5種成分色譜峰峰形尖銳，分離度好。流速分別考察了1.0、1.5和2.0 mL/min 3種流速，經過多次試驗，最終選擇了2.0 mL/min流速，既可以保證分離效果同時大大縮短了時間，極大提高了工作效率。

2.3 提取方法的選擇

考察了加熱回流和超聲波兩種提取方法，測定結果無明顯差別，故選擇易操作的超聲法。對超聲提取時間(30、60和80 min)也做了考察，發現超聲30 min結果偏小，超聲60 min與80 min結果差別不明顯，故提取時間定為60 min。

2.4 線性方程與檢出限

分別吸取混標溶液5、10、20 、25、30 μL，按1.3色譜條件測試，以峰面積為縱坐標，標液濃度為橫坐標，繪制方程。

將混標溶液溶液不斷稀釋，按1.3色譜條件測試，通過測量11次空白溶液濃度的標準偏差，從而得出檢出限和定量限。5種組分的回歸方程，檢出限和定量限見表1。

2.5 精密度試驗

取混合標液20 μL，按1.3色譜條件測定6次，丹參素鈉、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍藥苷峰面積的RSD分別為1.3%、1.0%、1.1%、0.9%和1.2%(n=6)，表明儀器精密度良好。

表1 5種化合物線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限Tab.1 Linear range, linear equation, correlation coefficient, detection limit and quantification limit of 5 compounds

2.6 重復性試驗

取相同樣品6份，按1.2中的方法制備，按1.3中色譜條件進樣20 μL，分別測定丹參素鈉、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍藥苷的含量，結果平均含量分別為5.89、0.37、0.24、4.68和1.22 mg/g ，RSD分別為1.4%、1.4%、1.2、1.6和1.5%，說明本方法有較好的重復性。

2.7 穩定性試驗

分別于0、2、4、8、12、24 h測定樣品溶液，結果丹參素鈉、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍藥苷峰面積的RSD分別為1.81%、1.43%、1.12%、1.29%和1.34%，說明樣品溶液放置24 h具有良好的穩定性。

2.8 回收率試驗

取同一批樣品各1 g，置50 mL量瓶中，共6份，分別精密加入丹參素鈉、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍藥苷單標溶液3.5 mL、0.8 mL、0.6 mL、2.5 mL和3 mL，按1.2中方法制備，分別測定，得到加標回收率，結果見表2。由表2可知，平均回收率范圍在99.18%～101.69%，說明此方法有良好的準確性。

表2 回收率試驗Tab.2 Recovery test

續表2

3 結語

建立了冠心生脈丸中丹參素鈉、芍藥苷、丹酚酸B、五味子醇甲、丹參酮ⅡA 5種成分含量同時測定的高效液相色譜方法。測定的5種物質涉及冠心生脈丸中3種重要中藥材，為冠心生脈丸藥品質量監控提供了重要方法。