舒林酸對高脂飼養(yǎng)大鼠胰島素抵抗的影響

顧鳴宇，林毅，馬宇航，熊川浩，蓋顯英，丁曉穎，彭永德

1.南京醫(yī)科大學上海市第一人民醫(yī)院 上海交通大學醫(yī)學院附屬上海市第一人民醫(yī)院內分泌代謝科,上海 200080;2.上海市松江區(qū)泗涇醫(yī)院內分泌科

我國糖尿病患病率快速上升，胰島素抵抗(IR)是糖尿病的病理生理機制之一[1]。既往研究顯示，全身的炎癥反應參與了胰島素抵抗的發(fā)生，抑制慢性、亞臨床性炎癥可能成為篩選治療IR和2型糖尿病藥物的新靶點[2]。目前已證實兼有一定抗炎作用的藥物包括原有的降糖藥(二甲雙胍、格列酮類等)、部分調脂藥和降壓藥等均具有改善胰島素抵抗的作用[3]。水楊酸鹽是臨床常用的抗炎藥物，既往研究顯示大劑量的水楊酸鹽可通過調節(jié)肥胖誘導的胰島素信號轉導通路和作用缺陷而防止和改善胰島素抵抗[4]。但是阿司匹林等水楊酸鹽發(fā)揮改善胰島素抵抗作用時服用劑量較大，會引起消化道出血等并發(fā)癥，影響了其在改善胰島素抵抗中的應用。舒林酸(Sulinda)是一種廣泛應用于臨床的非甾體類抗炎藥物。其抗炎作用為阿司匹林的16倍，而胃腸道潛在出血率約是阿司匹林的1/10。較小的起效劑量和較低的副作用使這類抗炎藥物可望成為改善IR的新藥[5]。本研究團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)，舒林酸可以通過改善胰島素受體底物1(IRS1)絲氨酸/酪氨酸磷酸化狀態(tài)來緩解白細胞介素(IL)-1β誘導的3T3L1成熟脂肪細胞胰島素抵抗[6]。在本研究中，通過觀察舒林酸對飲食誘導胰島素抵抗大鼠糖代謝狀態(tài)的改變，以及舒林酸對大鼠胰島素靶組織信號轉導通路蛋白IRS1絲氨酸(Ser)/酪氨酸(Tyr)磷酸化狀態(tài)的影響，在體內試驗探討舒林酸改善胰島素抵抗的作用，為臨床糖尿病患者選擇抗感染治療方案，輔助改善胰島素抵抗提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 本研究使用的舒林酸購買自Sigma-Aldrich(純度≥98%)，胰島素購買自Eli-Lilly；IRS1 抗體購買自Cell Signal Technology；IRS1-Tyr抗體和IRS1-Ser抗體購買自Upstate Biotechnology；大鼠胰島素檢測試劑盒(放射免疫分析法)購自Linco Research。

1.2 研究方法

1.2.1 高脂飼養(yǎng)大鼠胰島素抵抗模型制備及分組 3周齡雄性SD大鼠20只，體重60～80 g，購自上海斯萊克實驗動物中心。適應性飼養(yǎng)3 d后隨機分為2組：普食組(Chow組)，5只；高脂飼養(yǎng)組(HFD組)，15只。飼養(yǎng)20周后所有大鼠行口服糖耐量試驗(OGTT)，10只HFD肥胖大鼠胰島素抵抗造模成功，再隨機分為2組高脂飼養(yǎng)組(HFD組)和舒林酸組(S組)，舒林酸組在高脂飼養(yǎng)下予以舒林酸100 mg·kgBW-1·d-1灌胃[舒林酸溶于二甲基亞砜(DMSO)中]；高脂飼養(yǎng)組繼續(xù)高脂飼養(yǎng)，Chow組繼續(xù)普食，高脂飼養(yǎng)組和Chow組同時予舒林酸組同樣容積的DMSO溶媒灌胃。4周后所有大鼠稱重后，分別予高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗。

1.2.2 大鼠口服葡萄糖耐量試驗 大鼠禁食10 h后，眶后靜脈竇取血，50%葡萄糖 2 g/kgBW灌胃，2 h后取尾靜脈尖血用One Touch Ⅱ型血糖儀檢測微量法血糖。

1.2.3 大鼠高胰島素正糖鉗夾試驗 大鼠禁食10 h后，戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定在動物臺上，頸靜脈置管用于胰島素和葡萄糖的輸入，頸動脈置管用于采血。蠕動泵恒定地注入速效胰島素(6.0 mU·kg-1·min-1)，每10 min經動脈采血測定血糖，根據(jù)血糖值調節(jié)葡萄糖(20%)的輸入速度，經過100～140 min后鉗夾試驗進入穩(wěn)定期，以穩(wěn)定期血糖值和葡萄糖的輸入速度計算葡萄糖清除率(GDR)。GDR(mg·kg-1·min-1)=穩(wěn)定期葡萄糖的平均輸入速度×葡萄糖液濃度/大鼠體重。

1.2.4 靶組織胰島素信號轉導通路的變化 取大鼠的骨骼肌提取蛋白，利用蛋白免疫印跡(Western Blot)的方法檢測骨骼肌組織IRS1以及IRS1-Tyr和IRS1-Ser的表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。對于符合正態(tài)分布的變量，組間比較采用SNK法(Student Newman-Keuls)；方差不齊時，行Dunnett′s T3檢驗。非正態(tài)分布變量，經變量轉換成近似正態(tài)分布或采用非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較和血液學檢測指標的變化 HFD組大鼠平均體重高于Chow組和S組，P值均<0.05。HFD組大鼠餐后血糖高于Chow組,P<0.01。HFD組大鼠三酰甘油水平高于Chow組和S組(P值均<0.05)。見表1。

表1 不同干預因素對大鼠體重糖、脂代謝指標的影響

2.2 葡萄糖耐量和鉗夾試驗對不同干預因素組大鼠糖代謝的影響 在高胰島素正葡萄糖鉗夾穩(wěn)態(tài)期，機體整體胰島素敏感性由GDR判定。干預后，HFD組大鼠GDR(7.87 mg·kg-1·min-1)低于Chow組(10.45 mg·kg-1·min-1)，P<0.05；S組高于HFD組(12.39 mg·kg-1·min-1)，提示葡萄糖清除率升高，胰島素敏感性改善(P值分別<0.01和<0.05)。

2.3 不同干預因素對大鼠骨骼肌組織胰島素信號通路蛋白表達的影響 圖1顯示了不同干預因素對大鼠骨骼肌組織IRS1、IRS1-Tyr、IRS1-Ser表達的影響，結果表明HFD、S組間IRS1表達水平差異無統(tǒng)計學意義，S組IRS1-Tyr表達水平顯著高于HFD組而IRS1-Ser較HFD組有下降趨勢。

圖1 不同干預因素對大鼠骨骼肌IRS1、IRS1-Tyr、IRS1-Ser表達的影響

3 討論

胰島素抵抗是糖尿病的重要發(fā)病機制之一，炎癥導致胰島素抵抗的分子機制是近幾年研究的熱點[7-8]。生理情況下，胰島素與胰島素受體結合后，胰島素受體磷酸化導致胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化，激活其下游底物，將胰島素信號轉導至效應器[9]。炎癥因子激活的一系列激酶也可以使胰島素受體底物發(fā)生磷酸化，但是作用部位在酪氨酸附近的絲氨酸/蘇氨酸上，一旦絲氨酸/蘇氨酸磷酸化就會干擾酪氨酸的磷酸化，導致胰島素受體底物和胰島素受體的結合松散，激活下游底物磷脂酰肌醇-3激酶的能力下降或可促進胰島素受體底物的降解，從而減弱了胰島素信號轉導，引起胰島素抵抗[10]。

近年來研究顯示抑制炎癥反應可以改善胰島素抵抗。有研究報道大劑量阿司匹林治療可使代謝綜合征患者空腹血糖降低25%，CRP和總膽固醇降低約15%，三酰甘油降低近50%，可使肝臟葡萄糖輸出減少約20%，同時增加胰島素介導的周圍組織葡萄糖攝取達30%[11]。本研究觀察了另一種非甾體類抗炎藥舒林酸對高脂飲食誘導胰島素抵抗的作用。本研究應用高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術對模型動物進行胰島素敏感性的評價，高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術是評估胰島素抵抗的金標準[12]。本研究結果顯示，HFD組大鼠GDR較Chow組顯著下降(P<0.05)，提示高脂飼養(yǎng)胰島素抵抗肥胖大鼠建模成功。進一步觀察舒林酸干預的高脂大鼠GDR的變化，發(fā)現(xiàn)舒林酸組(S組)的GDR水平較HFD組明顯升高，提示舒林酸干預后大鼠胰島素抵抗得到了改善。

IRS家族是參與胰島素信號轉導的關鍵蛋白，其中IRS1及其磷酸化水平在胰島素受體后信號轉導通路中對胰島素生物學效應起到重要作用[13]。IRS1絲氨酸(Ser307)磷酸化在介導胰島素生物學效應負反饋調節(jié)方面起重要作用，是目前糖尿病和肥胖狀態(tài)下IR的主要分子水平指標[14]。本研究用Western blot方法檢測了各組大鼠骨骼肌組織IRS1酪氨酸、絲氨酸的磷酸化水平。結果顯示，舒林酸組(S組)大鼠肝臟IRS1酪氨酸磷酸化表達水平上調，IRS1絲氨酸磷酸化表達水平較HFD組有下降趨勢。提示舒林酸可能通過調節(jié)大鼠IRS1酪氨酸、絲氨酸的磷酸化水平來改善高脂引起的胰島素抵抗。既往研究人員發(fā)現(xiàn)舒林酸可調節(jié)NF-κB的轉錄活性[15]。在脂肪細胞中抑制NF-κB的活性可減少腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6等炎癥因子的釋放，TNF-α等炎癥因子能造成IRS1在胰島素刺激下其酪氨酸磷酸化能力降低[16]。故推測舒林酸是通過調節(jié)NF-κB信號通路改善炎癥狀態(tài)進而影響到胰島素信號通路。此外，舒林酸是過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)的配體之一[17]。PPARγ是調節(jié)脂肪細胞分化、脂質代謝、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性的主要調節(jié)因子。PPARγ的配體如吡格列酮、羅格列酮等都可有效增加2 型糖尿病患者的胰島素增敏作用并改善血糖控制。舒林酸及其衍生物也可能通過調節(jié)PPARγ起到改善胰島素抵抗的作用[18]。本研究為舒林酸干預與胰島素敏感性相關關系的初步探索，仍有一定的局限性：研究樣本量較小，未來需進一步擴大樣本量驗證該結論。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在體內試驗中舒林酸可通過調節(jié)IRS1 Ser /Tyr殘基的磷酸化水平從而改善高脂飲食引起的胰島素抵抗。這為舒林酸在臨床中應用于改善胰島素抵抗提供了理論基礎，但舒林酸改善胰島素抵抗的分子機制仍未明確，未來有待更進一步的臨床和基礎研究探討和闡明。