QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定蜂蜜中19種喹諾酮類抗生素

倪楊 楊軍軍 石磊 張瑩瑩 熊融

（北京市農林科學院林業果樹研究所，北京市落葉果樹工程技術研究中心，農業農村部果品及苗木質量監督檢驗測試中心（北京），北京 100093）

蜂蜜是一種營養豐富的天然滋養食品，富含多種氨基酸、維生素和礦物質元素，具有抗菌、抗氧化、提高免疫力等功效，能夠預防和治療多種疾病，是深受人們喜愛的“藥食同源”蜂產品[1]。隨著蜂蜜營養價值認可度的不斷提高，對其消費需求和質量要求也在不斷提升，然而蜂蜜摻假、藥物殘留超標等不良事件的發生，嚴重影響了蜂蜜產業的健康發展，獸藥殘留量已成為衡量蜂蜜產品質量的重要指標之一[2]。

喹諾酮類藥物為人工合成的含4-喹諾酮基本結構的廣譜抗生素，可作用于細菌的脫氧核糖核酸的回旋酶，使細胞無法分裂，從而起到抗菌效果[3]。該類藥物目前已發展到第五代，為人畜共用，可預防不同種類動物的疾病，在蜂業生產中通常用來防治和治療各類細菌性疾病，尤其可以有效防治美洲幼蟲腐臭病引起的蜜蜂數量減少和蜂蜜產量降低[4]。因此，我國部分地區的蜂農在養殖過程中直接飼喂或在蜂巢中噴灑獸藥，不合理用藥或藥物濫用致使其在蜂蜜中殘留。喹諾酮類藥物在動物體內代謝緩慢，容易產生蓄積，人類若長期食用含有喹諾酮類藥物的食品，會誘導致病菌產生耐藥性；若過量食用此類藥物，還會出現惡心、腹瀉、頭痛、眩暈，以及白細胞減少、肝損傷等不良反應，有致畸、致突變的潛在風險[5,6]。

因此，國內外對食品中的喹諾酮含量均進行嚴格限定。我國在GB 31650-2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中規定，恩諾沙星、達氟沙星、雙氟沙星和沙拉沙星在家禽產蛋期禁用，并規定了其他動物源食品中的最大殘留限量；2015年《中華人民共和國農業部公告第2292號》文件，明令禁止洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥在動物食品中使用。歐盟規定了麻保沙星、環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氟甲喹和噁喹酸的最大殘留限量，此類抗生素藥物也未被授權用于治療蜜蜂疾病[7]。由于沒有蜂蜜中抗生素類藥物最大殘留限量值的規定，我國養蜂業禁止使用喹諾酮類藥物，因此有必要建立蜂蜜中多種喹諾酮類藥物的痕量檢測方法[8]。

目前，蜂蜜中喹諾酮類藥物的檢測方法有薄層色譜法[9]、三維熒光光譜法[10]、高效液相色譜法[1112]等，其中薄層色譜法適用于定性分析，三維熒光光譜法僅可同時檢測幾種目標化合物，高效液相色譜法定性易受假陽性干擾，但當高效液相色譜法與質譜聯用，憑借強大的分離能力和較好的靈敏度、準確性，已經發展成為獸藥檢測領域最為可靠的定性定量分析方法[13-18]。但目前液質檢測法前處理多數使用HLB固相萃取柱[19]或陰離子交換柱[20]進行凈化，不但其選擇性和除雜富集效果有待提高，因其操作復雜、過柱時間長且成本較高，不適合大批量快速檢測。本研究綜合利用QuEChERS前處理方法和UPLC-MS/MS的優勢，在借鑒以往文獻中有關喹諾酮類藥物提取、凈化的基礎上，建立了蜂蜜中19種喹諾酮類藥物殘留量的快速檢測方法，以期為監測、評估蜂蜜中多組分喹諾酮類藥物的污染風險評估和確證檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜樣品購于超市和集市，于-20 ℃保存；19種喹諾酮類藥物標準溶液（100 μg/mL）：恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、環 丙 沙 星（Ciprofloxacin，CIP）、諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、雙氟沙星（Difloxacin，DIF）、噁喹酸（Oxolinic acid，OXO）、氟甲喹（Flumequine，FLU）、沙拉沙星（Sarafloxacin，SAR）、司 帕 沙 星（Sparfloxacin，SPA）、丹氟沙星（Danofloxacin，DAN）、氟羅沙星（Fleroxcain，FLE）、馬波沙星（Marbofloxacin，MAR）、伊諾沙星（Enoxacin，ENO）、奧比沙星（Orbifloxacin，ORB）、吡哌酸（Pipemidic acid，PIP）、培氟沙星（Pefloxacin，PEF）、洛美沙星（Lomefloxacin，LOM）、西諾沙星（Cinoxacin，CIN）、奈啶酸（Nalidixic acid，NAL） 農業農村部環境保護科研監測所；乙腈、甲醇（色譜純） 美國Fisher公司；甲酸、乙酸銨、氯化鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；PSA、C18、FLPR 日本島津公司；HLB 上海連橋生物科技有限公司；微孔過濾膜（13 mm×0.22 μm，尼龍） 北京迪科馬科技有限公司；ACQUITY BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；氬氣（純度＞99.9%） 北京氦普北分氣體工業有限公司；實驗用水為超純水（電阻率大于18.2 MΩ·cm）由Milli-Q超純水機制備。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC I-Class液相色譜儀 美國Waters公司；Xevo TQ-S質譜儀（配有ESI及Masslynx4.1數據處理系統） 美國Waters公司；Milli-Q超純水機美國Millipore公司；GL-20G-II高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；FE20型實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-600DB超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司；QL-8BB旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PL2002電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

混合標準溶液：分別移取一定體積的19種標準溶液于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇稀釋并定容至刻度線，得到混合標準溶液，其中FLU、NAL質量濃度為50 μg/L，其余17種喹諾酮類藥物質量濃度均為20 μg/L。

基質混合標準溶液：選取經檢測不含19種喹諾酮類藥物的空白蜂蜜樣品，按照1.3.1節進行樣品前處理，制備空白基質溶液，用其配制不同質量濃度的系列基質混合標準工作液，現配現用。其中，FLU、NAL的標準工作曲線濃度分別為0.5、1、5、10、25、50 μg/L，其余17種抗生素的標準工作曲線濃度均為0.2、1、2、5、10、20 μg/L。

1.3.2 樣品前處理

將蜂蜜樣品攪拌均勻，稱取5.00 g置于50 mL旋蓋離心管中，加入5 mL超純水渦旋振蕩溶解，再加入10 mL乙腈溶液超聲提取5 min，然后加入3 g氯化鈉，渦旋振蕩1 min后靜置分層。吸取3 mL有機相置于內含0.2 g C18的15 mL離心管中，渦旋振蕩0.5 min后，靜止3 min，過0.22 μm有機濾膜于樣品瓶中，待測分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL/min；流動相：A為乙腈，B為0.1 %甲酸-水溶液；梯度洗脫程序：0～0.5 min、90 % B，0.5～1.0 min、90 %～40 % B，1.0～3.0 min、40 %～10 % B，3.0～4.0 min、10 % B，4.0～4.5 min、90 % B；進樣量：2 μL。

1.3.4 質譜條件

電離源：ESI；掃描方式：正、負離子同時掃描；檢測模式：MRM；毛細管電壓：2.5 kV；離子源溫度：150 ℃；錐孔電壓：40 V；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：650 L/h；碰撞氣：氬氣。

1.4 數據分析

通過Waters Masslynx儀器配置工作站系統進行數據采集，利用Excel軟件、R語言進行數據分析及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

混合標準工作液直接進樣進行正負離子掃描，目標化合物均在正離子[M+H]+模式下響應值最高，增加碰撞能量和錐孔電壓，獲得離子碎片信息。選擇相對較強的2個離子作為定量、定性離子對，最后優化裂解電壓、碰撞能量使目標物響應值達到最大，最終確定掃描模式為正離子模式，19種喹諾酮類藥物MRM質譜參數如表1所示。

表1 19種喹諾酮類藥物檢測質譜參數

2.2 色譜條件的優化

反相液相色譜中，最常用的流動相體系為甲醇-水和乙腈-水兩種，并通過加入少量甲酸、乙酸、乙酸銨、甲酸銨等降低流動相pH值來改善峰形、提高質譜離子化效率[8、16]。實驗發現甲醇與水相混合后柱壓升高，且保留時間延遲，因此選擇乙腈為有機相，并分別與超純水、5 mmol/L乙酸銨水溶液、0.05%甲酸水溶液組合流動相，比較19種喹諾酮類藥物的色譜峰分離效果及峰形情況。結果表明，乙腈分別與超純水、5 mmol/L乙酸銨水組合時，目標化合物的峰形較差，且豐度和靈敏度較低。為提高化合物響應強度，在水相中加入低濃度甲酸后，峰形對稱性明顯得到改善，并且響應值增強。進一步考察不同濃度甲酸（0.01%、0.05%、0.1%）對被測組分的影響，以乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時，目標物的色譜峰形和響應強度最佳，保留時間穩定（詳見圖1）。

圖1 19種喹諾酮類藥物的MRM色譜圖

2.3 樣品前處理的優化

由于蜂蜜不易溶于有機溶劑，因此通常用純水溶解蜂蜜樣品，在勻質的蜂蜜水溶液中加入提取溶劑，甲醇、乙腈是目前最常用的提取劑[8,16,19]，甲醇比乙腈具有更好的溶解性，易將樣品中的糖、酸、色素、蛋白質等物質提取出來，致使提取液中雜質較多，不利于后續的鹽析和凈化，而乙腈對蛋白的沉淀作用較強且共提物少，因此選擇乙腈作為提取劑。

QuEChERS前處理過程中加入鹽析劑（1 g NaCl和4 g 無水MgSO4）[21]可以促進目標化合物由水相分配至有機相，利于水相與有機相分層，實驗對比NaCl、無水MgSO4、無水Na2SO4對喹諾酮類藥物回收率的影響。結果發現，添加3 g NaCl，渦旋振蕩1 min后靜置，即可使兩相溶液分層完全、清透，且對目標化合物的回收率最好。

為了獲得更好的回收率，減少蜂蜜樣品提取溶液中糖、酸、色素的影響，需要對提取液進行凈化除雜。PSA可以吸附多種極性有機酸、極性色素以及部分糖類和脂肪酸；C18可以吸附非極性的干擾物質，如脂肪；FL-PR屬于硅酸鎂型吸附劑，吸附性強，可以從非極性溶液中萃取極性化合；HLB屬于親水親脂平衡聚合物填料，萃取非極性至中等極性的酸性、中性、堿性化合物。實驗以空白蜂蜜樣品的加標回收實驗，分別比較了0.2 g的PSA、C18、FL-PR、HLB對19種喹諾酮類藥物凈化回收的效果（n=3）。結果發現，選用0.2 g C18為凈化劑，目標化合物回收率范圍在82.1%～95.4%之間，回收率最高，考慮實驗成本及可操作性，本方法選用0.2 g C18對提取液進行凈化處理。

2.4 方法學評價

2.4.1 基質效應

為評價基質效應，采用基質標與溶劑標曲線斜率的比值考察了19種喹諾酮類藥物在蜂蜜中的信號增強/抑制程度（signal suppression/enhancement, SSE），SSE值大于1.2表示基質增強效應，小于0.8表示基質抑制效應，在0.8～1.2之間則視為基質效應影響不大[22]。由表3得知，在蜂蜜基質中，CIP、SAR和ENO的SSE值在0.80～0.85范圍內，屬于弱抑制效應；OFL、DAN和LOM的SSE值在1.15～1.20范圍內，屬于弱增強效應，采用基質匹配標樣來對蜂蜜中的喹諾酮類藥物進行定性和定量分析。

表2 凈化劑對19種喹諾酮類藥物回收率的影響（n=3）

表3 19種喹諾酮類藥物在蜂蜜中的基質效應

2.4.2 線性關系、LODs與LOQs

取空白蜂蜜樣品，按照1.3.2進行樣品前處理，分別配制一系列濃度的基質混合標準工作液，上機測定后，以色譜峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X），繪制19種喹諾酮類藥物的基質標準曲線，并以定性通道的3倍信噪比（S/N=3）、定量通道的10倍信噪比（S/N=10）確定各化合物的LODs和LOQs[23]。結果表明，19種目標化合物在各自質量濃度范圍內，峰面積與質量濃度呈現良好線性關系（R2＞0.995），LODs和LOQs分別為0.25～0.50 μg/kg和0.80～1.50 μg/kg，本方法具有良好的定性和定量分析能力。

表4 19種喹諾酮類藥物的線性范圍、線性方程、相關系數、LODs和LOQs（n=6）

2.4.3 回收率與精密度

選取空白蜂蜜樣品，分別按照低、中、高3個濃度水平加入適量19種喹諾酮類藥物的標準工作液，每個濃度做6個平行樣，以本文上述方法處理樣品并測定濃度，計算加標回收率和RSDs。結果表明，各化合物在低濃度添加量（1 μg/kg）下的平均回收率為78.9%～92.2%，RSDs為2.0%～4.6%；在中濃度添加量（5 μg/kg）下的平均回收率為80.6%～94.2%，RSDs為1.8%～4.1%；在高濃度添加量（10 μg/kg）下的平均回收率為85.2%～96.5%，RSDs為2.0%～4.9%，滿足GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》和GB 31657.2-2021《食品安全國家標準 蜂產品中喹諾酮類藥物多殘留的測定 液相色譜-串聯質譜法》的相關要求。

2.5 實際樣品測定

為驗證本方法的適用性，選取超市蜂蜜樣品10份、蜂農自產自銷蜂蜜樣品5份進行分析。其中，超市售賣的蜂蜜均未檢出19種喹諾酮類藥物，而蜂農銷售的蜂蜜中，有3份樣品檢出NOR，其含量分別為0.68 μg/kg、3.15 μg/kg、5.82 μg/kg。根據《中華人民共和國農業部公告第2292號》文件規定，在食品動物中停止使用NOR、LOM、PEF、OFL 4種獸藥，即在蜂蜜中不得檢出，本次抽檢結果應給予持續關注。

3 結論

本研究建立了QuEChERS前處理技術結合UPLC-MS/MS同時測定蜂蜜中19種喹諾酮類藥物的快速檢測方法。實驗優化了前處理方法及色譜質譜條件，使目標化合物擁有較好的分離效果和較高的檢測靈敏度。樣品以ACQUITY BEH C18色譜柱分離，在ESI正離子掃描模式下，采用MRM模式測定，19種喹諾酮類藥物在3 min內完成色譜分離分析，在相應的質量濃度范圍內，各目標物在蜂蜜中均呈現良好線性關系，LODs和LOQs分別為0.25～0.50μg/kg、0.80～1.50 μg/kg。以蜂蜜基質在低、中、高3個添加濃度水平下的加標回收實驗，平均回收率為78.9%～96.5%，RSDs為1.8%～4.9%，符合檢測方法確認的相關要求。該方法操作簡單、精密度好、靈敏度高、分析速度快，能夠滿足蜂蜜中喹諾酮殘留分析的需求。

表5 19種喹諾酮類藥物的平均回收率和RSDs（n=6）