新型鴨呼腸孤病毒研究進(jìn)展

馬明瑞，陳 浩，張 斌

（1.內(nèi)蒙古師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022；2.曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

新型鴨呼腸孤病毒（Novel Duck Reovirus，NDRⅤ）隸屬于呼腸孤病毒科（Reovirdae）、正呼腸孤病毒屬（Orthoreovirus），其基因組由10個(gè)雙鏈RNA片段組成[1]。在臨床上，NDRⅤ會(huì)降低雛鴨出雛率，在雛鴨或成鴨感染早期無(wú)明顯特殊癥狀，但在后期鴨子生長(zhǎng)發(fā)育變得遲緩，導(dǎo)致體重偏輕，同時(shí)生產(chǎn)性能急劇下降，表現(xiàn)出精神萎靡，羽毛凌亂、粗糙以及排白色稀糞等癥狀。該病發(fā)病日齡較小，多發(fā)生于3～25日齡，病程為5～7日。病原可通過(guò)消化道和呼吸道感染，病情發(fā)展迅速。脾臟和法氏囊是病毒感染的主要靶器官，淋巴細(xì)胞是主要的靶細(xì)胞，病毒感染后引起脾臟壞死導(dǎo)致免疫力下降，易受其他病原微生物感染（霉菌毒素及其他病毒混感），因此死亡率較高。剖檢病變?yōu)楦闻K表面出現(xiàn)大量針尖大小的白色壞死灶和大量出血點(diǎn)，脾臟腫大，有出血的癥狀，呈暗紅色，表面有許多灰白色的壞死點(diǎn)，有的匯聚在一起呈花斑狀。心臟、腎臟、法氏囊等有時(shí)也能見(jiàn)到出血病變。呼腸孤病毒感染已成為危害我國(guó)禽生產(chǎn)的主要疫病之一，該病的發(fā)病流行沒(méi)有明顯的季節(jié)性，多種水禽都可以感染呼腸孤病毒，并因此發(fā)病和死亡，或引起繼發(fā)感染，造成更大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。NDRⅤ的傳播方式可分為水平傳播和垂直傳播兩種。水平傳播是帶毒家禽之間直接或者間接引起的；垂直傳播主要是通過(guò)卵的傳播。在生殖器中已經(jīng)證明該病毒的存在，但是經(jīng)過(guò)卵傳播的概率較低[3]。近年來(lái)，該病在我國(guó)部分省市均有發(fā)生，嚴(yán)重影響了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。我國(guó)不同地區(qū)流行的不同呼腸孤病毒株具有宿主差異性、地域差異性及致病性多樣化的特征，這些病毒基因組具有多樣性且容易發(fā)生基因突變，易形成新的致病毒株，對(duì)水禽養(yǎng)殖業(yè)造成新的危害。本研究梳理了NDRⅤ的生物學(xué)特征、流行病學(xué)及診斷方式等，綜述如下。

1 生物學(xué)特征

1.1 分類學(xué)地位

NDRⅤ是新型鴨呼腸孤病毒病的病原，是呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬的一種。其病毒粒子為二十面體對(duì)稱的球形結(jié)構(gòu)。NDRⅤ是無(wú)囊膜結(jié)構(gòu)，具有雙層核衣殼的分節(jié)段的雙鏈RNA病毒，直徑60～80 nm[4]（見(jiàn)圖1）。

圖1 NDRV（圖片摘自https://viralzone.expasy.org/）

1.2 理化特性和培養(yǎng)特性

NDRⅤ病毒粒抵抗力較強(qiáng)，對(duì)氯仿、乙醚等不敏感，對(duì)3.0%甲醛、0.5%有機(jī)碘和熱敏感。NDRⅤ接種一般采用卵黃囊接種和絨毛尿囊膜接種這兩種方式，其他接種方式在病毒的增殖效果穩(wěn)定性上不及卵黃囊接種和絨毛尿囊膜接種[5-6]。

1.3 分子生物學(xué)特性

NDRⅤ是一種分節(jié)段的dsRNA，病毒基因組總大小為23.5 kb。陳仕龍等[7]對(duì)NDRⅤ進(jìn)行核酸節(jié)段研究，結(jié)果表明，NDRⅤ在SDS-PAG中具有禽呼腸孤病毒的特征：由10個(gè)RNA片段組成，包括3個(gè)長(zhǎng)片段L1、L2和L3，3個(gè)中片段M1、M2、M3以及4個(gè)小片段S1、S2、S3、S4[8]。與MDRⅤ相比，L片段遷移率大致相同，M、S遷移率均有差異，S1同源性最低，具有高度變異性，差異最大。NDRⅤ的基因組編碼14種蛋白，包括10種結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的復(fù)制、增殖、感染、傳播等過(guò)程中具有重要作用[9]。基因組編碼蛋白主要功能如表1所示。

表1 基因組編碼蛋白主要功能

2 流行病學(xué)—臨床癥狀及病理變化

新型鴨呼腸孤病毒病一年四季均能發(fā)生，天氣炎熱潮濕時(shí)發(fā)病率會(huì)上升。NDRⅤ通過(guò)垂直傳播方式和水平傳播方式在諸多品系的鴨中傳染，發(fā)病率較高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NDRⅤ感染具有明顯的年齡依賴性，28日齡以內(nèi)雛鴨易發(fā)，主要以肝脾組織出現(xiàn)壞死性病變?yōu)樘卣鳎瑢?dǎo)致免疫抑制，常引起繼發(fā)感染或混合感染。NDRⅤ感染會(huì)引起鴨出血性壞死性肝炎和雛鴨脾壞死癥這兩種癥狀，發(fā)病日齡相似，但患脾壞死癥的雛鴨病程會(huì)略長(zhǎng)于患鴨出血性壞死性肝炎的雛鴨，其死亡率也高于患鴨出血性壞死性肝炎的雛鴨。大多數(shù)成年鴨感染NDRⅤ后無(wú)明顯臨床癥狀，但后期發(fā)現(xiàn)鴨子體重偏輕。由于其水平傳播特性，病鴨感染后排毒十余天，其中，3～6天是排毒高峰期[10]。

病鴨的表現(xiàn)為精神沉郁萎靡、乏力，多蹲伏或擠堆，吃料減少或不食，羽毛凌亂無(wú)光澤，腹瀉，排白色稀糞，少飲嘶叫，甚至出現(xiàn)倒頭的現(xiàn)象。病程長(zhǎng)短不一，一般為2～14天，在發(fā)病后的5～7天內(nèi)是死亡高峰期。2周齡以內(nèi)患病鴨死亡率極高，能耐過(guò)的病鴨也會(huì)發(fā)育不良，生長(zhǎng)發(fā)育變得十分遲緩，成為僵鴨，失去飼養(yǎng)價(jià)值[11]。

剖檢病死鴨的病理變化主要表現(xiàn)為肝臟略大，肝臟表面出現(xiàn)大量針尖大小的白色壞死灶和大量出血點(diǎn)，質(zhì)脆[12]；脾臟腫大、斑塊狀壞死，脾臟出血，有的心臟出血；腎臟和法氏囊出血。武鴻等[13]從病鴨的組織病料中剖檢發(fā)現(xiàn)，脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、組織細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞變性。病理組織學(xué)變化為肝細(xì)胞不同程度地變性或壞死崩解呈局灶性，其間夾雜出血灶并出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腎臟出血水腫，腎小管上皮細(xì)胞變性并與基底膜脫離；心臟出現(xiàn)間質(zhì)性心肌炎，心肌纖維萎縮，間隙增大，并見(jiàn)炎性細(xì)胞和出血灶；脾臟出血，淋巴細(xì)胞減少、崩解形成壞死灶；法氏囊黏膜下出血，黏膜上皮壞死脫落，淋巴濾泡和淋巴細(xì)胞減少[14-15]。

3 診斷方法

3.1 臨床診斷

首先，根據(jù)患鴨的臨床癥狀判斷其是否出現(xiàn)精神沉郁萎靡，吃料飲水減少或不食，多蹲伏或擠堆，羽毛凌亂無(wú)光澤，腹瀉、排白色稀糞等癥狀，是否出現(xiàn)倒頭現(xiàn)象，是否出現(xiàn)角弓反張等神經(jīng)癥狀，判斷是否患新型鴨呼腸孤病毒病。其次，對(duì)患鴨進(jìn)行剖檢，查看各臟器是否有不同程度的病變且符合上述病理變化特征。根據(jù)這些病理的特點(diǎn)，臨床上常稱其為“鴨新肝病”“鴨出血性壞死性肝炎”“鴨脾壞死病”等[16-18]。

根據(jù)臨床癥狀和剖檢病理變化可以初步判斷患鴨是否患有新型鴨呼腸孤病毒病，然后可通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)一步確診[19]。

3.2 病原學(xué)判斷

3.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種目前在新型鴨呼腸孤疫病診斷方面應(yīng)用廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果表現(xiàn)形式清晰明了，準(zhǔn)確度高、靈敏度高，適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測(cè)方法可對(duì)感染NDRⅤ樣品進(jìn)行快速鑒別診斷，具有重要意義。

3.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在常規(guī)RT-PCR反應(yīng)體系中通過(guò)染料法或探針?lè)ǚe累熒光信號(hào)與已經(jīng)制訂好的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)[20]，實(shí)現(xiàn)對(duì)監(jiān)測(cè)對(duì)象的定量分析，具有高敏感性和定量精確等優(yōu)點(diǎn)，與常規(guī)RT-PCR技術(shù)相比，具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。

3.2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是在等溫（60～65 ℃）條件下，在短時(shí)間內(nèi)完成快速高效的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，且擴(kuò)增的特異性較高[21]。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，無(wú)需凝膠電泳，反應(yīng)時(shí)間較短，用肉眼即可直接觀察結(jié)果，特別適合基層養(yǎng)殖戶的快速檢測(cè)，同時(shí)也為該病的流行病學(xué)調(diào)查提供了有用工具。

3.3 血清學(xué)診斷

3.3.1 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法快捷、簡(jiǎn)單，可以應(yīng)用于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，檢測(cè)時(shí)將特異性抗原溶液和抗體放在半固體介質(zhì)中，讓其自由擴(kuò)散，這時(shí)抗原和抗體就會(huì)相互結(jié)合。若形成一條白色沉淀線，即可判定結(jié)果為陽(yáng)性。李靜等[5]通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法對(duì)興化市100份規(guī)模化鴨場(chǎng)的血清進(jìn)行呼腸孤病毒調(diào)查，結(jié)果證明，因季節(jié)和鴨生長(zhǎng)階段不同，禽呼腸孤病毒流行情況不同。

3.3.2 中和試驗(yàn)

血清中和試驗(yàn)是一種特異性強(qiáng)、敏感性高的血清學(xué)監(jiān)測(cè)方法，通過(guò)血清與病毒發(fā)生中和作用進(jìn)行鑒別診斷。

3.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是目前常用的一種血清學(xué)監(jiān)測(cè)方法，被廣泛應(yīng)用于各種傳染性疾病的診斷和抗體水平的評(píng)價(jià)，是一種用于NDRⅤ抗體檢測(cè)的快速、靈敏、特異方法。建立NDRⅤ的ELISA檢測(cè)方法，能更加快速簡(jiǎn)便、省時(shí)省力地篩檢大量樣品，可實(shí)現(xiàn)篩檢樣品自動(dòng)化。ELISA方法的建立為該病的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)，也為試劑盒的研發(fā)提供了數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)語(yǔ)

保持水禽養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展對(duì)促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、改善人民生活、增加出口物資等具有十分重要的意義。近年來(lái)，NDRⅤ在我國(guó)大面積流行，導(dǎo)致大量水禽養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)鴨脾臟壞死的現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙了水禽業(yè)的正常發(fā)展。我國(guó)不同地區(qū)流行的不同呼腸孤病毒株具有宿主差異性、地域差異性及致病性多樣化的特征，研究也顯示這些病毒基因組具有多樣性，病毒的毒力不同，組織親嗜性、抗原結(jié)構(gòu)、細(xì)胞培養(yǎng)特性亦不同，因此，仍需大量研究。目前，人們對(duì)NDRⅤ的基因結(jié)構(gòu)與功能研究尚有不足，獲得NDRⅤ全基因組序列數(shù)據(jù)的僅有13株（ZJ00M、J18、091、NP03、TH11、SD-12、SH12、HN5d、DH13、XT18、GX-Y7、DE150、SY），因此，仍需對(duì)我國(guó)NDRⅤ的流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查，豐富NDRⅤ的毒株信息庫(kù)；對(duì)NDRⅤ的特性進(jìn)行研究，為NDRⅤ疫病的防控和疫苗的研制提供重要材料。同時(shí)，目前學(xué)者對(duì)NDRⅤ致病機(jī)制的研究較少，仍需進(jìn)一步的研究。