黃芪對(duì)細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A 誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響

陳 越，彭 莉

（1.自貢市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 自貢 643000；2.成都市第七人民醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 成都 610000）

IgA 腎病（IgA nephropathy，IgAN）是一組臨床上以反復(fù)發(fā)作性的肉眼血尿或鏡下血尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)、病理上表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)IgA 沉積或以IgA 沉積為主要特征的原發(fā)性腎小球疾病[1]，并以腎小球系膜增生及細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加為其基本組織學(xué)改變，占我國(guó)終末期腎病病因的第1 位，占40%～47.2%[2]。在我國(guó)，IgAN 已成為導(dǎo)致慢性腎功能衰竭最主要的腎小球疾病[3]。過(guò)度增生與凋亡減少的腎小球系膜細(xì)胞均可引起細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度表達(dá)和聚積，從而導(dǎo)致腎小球系膜區(qū)增寬和基質(zhì)增生，最終導(dǎo)致腎小球硬化[4，5]。研究表明[6]，細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A（cytotoxin-associated protein A，CagA）具有促進(jìn)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖與細(xì)胞外基質(zhì)分泌的作用。在腎病綜合征的中藥治療中，黃芪（Astragalus Membranaceus）因具有活血化淤、益氣補(bǔ)血的作用，而被廣泛應(yīng)用于多種腎臟疾病的治療中，但其具體分子機(jī)制尚未完全闡明[7]。基于此，本研究通過(guò)觀察黃芪對(duì)CagA 誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響，探討其抑制系膜細(xì)胞外基質(zhì)分泌的作用機(jī)制，以期為IgA 腎病的防治研究提供思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 HBZY-1 細(xì)胞株（大鼠系膜細(xì)胞）：西南醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；IL-1β（R&D 公司，美國(guó)）；幽門(mén)螺桿菌CagA 蛋白（上海合星生物科技有限公司）；1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國(guó)）；黃芪注射液（每安瓿2 ml，2 g/ml，批號(hào)0306052）：購(gòu)自成都地奧九鴻制藥廠；PCR 儀（定量定性分析類(lèi)，Continuous fluorescence detector：CFD-3220，MJ，美國(guó)）；多功能酶標(biāo)儀（Infinite M200，TECAN，瑞士）；TRIzol（Invitrogen TRIzol，賽默飛，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠系膜細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇系膜細(xì)胞基于5%二氧化碳、37 ℃孵箱環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)基為加入滅活FBS（56 ℃滅活）的1640 培養(yǎng)基，并加入終濃度為0.1 mg/ml 的鏈霉素和100 U/ml 的青霉素，采倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組 培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞經(jīng)充分洗滌后，依據(jù)不同干預(yù)方法分為4 組：空白對(duì)照組、IL-1β 陽(yáng)性對(duì)照組（IL-1β 濃度10 ng/ml）、CagA 實(shí)驗(yàn)組（CagA 濃度4 μg/ml）、CagA+黃芪干預(yù)組（加入4 μg/ml 的CagA 和1 mg/ml 的黃芪注射液）。

1.2.3 樣本收集與保存 細(xì)胞刺激培養(yǎng)完成后，細(xì)胞懸液以1000 rpm 離心5 min，收集上清液，PBS 液洗滌2 次，采用Trizol 法重復(fù)離心收集細(xì)胞，并采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)提取的mRNA。收集的上清液再次以2500 rpm 離心20 min，上清液置于4 ℃冰箱用于當(dāng)日酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)，未完成檢測(cè)標(biāo)本上清液及逆轉(zhuǎn)錄cDNA 置于-70 ℃長(zhǎng)期保存。

1.2.4 檢測(cè)方法 ①采用ELISA 法檢測(cè)收集細(xì)胞上清液的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白濃度，采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 值，利用Curve Expert 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的Ⅰ、Ⅲ型膠原濃度；②采用RT-PCR 法檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA 表達(dá)，Trizol 法提取細(xì)胞RNA，采用RNA 瓊脂糖電泳驗(yàn)證提取RNA 的完整性，使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度、純度，合成引物序列：內(nèi)參照GAPDH（上游：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′；下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′）；ColⅢ（上游：5′-TAAAGGGTGAACGGGGCAGT-3′；5′-ACGTTCCCCATTATGGCCAC-3′）；RT-PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)；PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，采用Image J 軟件分析凝膠電泳條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)分泌水平比較 四組CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中IL-1β 陽(yáng)性對(duì)照組、CagA 實(shí)驗(yàn)組系膜細(xì)胞外基質(zhì)濃度高于空白對(duì)照組，CagA+黃芪干預(yù)組細(xì)胞外基質(zhì)濃度低于CagA 實(shí)驗(yàn)組，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)分泌水平比較（，μg/ml）

表1 各組大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)分泌水平比較（，μg/ml）

2.2 各組大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)mRNA 表達(dá)水平比較四組CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中IL-1β 陽(yáng)性對(duì)照組、CagA 實(shí)驗(yàn)組系膜細(xì)胞外基質(zhì)mRNA 表達(dá)水平高于空白對(duì)照組，CagA+黃芪干預(yù)組系膜細(xì)胞外基質(zhì)mRNA 表達(dá)水平低于CagA 實(shí)驗(yàn)組，見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA 表達(dá)比較

表2 各組大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)mRNA 表達(dá)水平比較（）

表2 各組大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)mRNA 表達(dá)水平比較（）

3 討論

IgAN 作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的原發(fā)性腎小球疾病，同時(shí)也是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要原因之一[8-11]，其病理學(xué)機(jī)制主要是以二聚體或多聚體的IgA 為主的免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)沉積[12]。正常情況下，IgA 主要由粘膜組織產(chǎn)生，而在IgAN中，腎外黏膜組織受抗原刺激后，會(huì)產(chǎn)生的異常IgA分子并在腎小球系膜區(qū)沉積，從而引起和促進(jìn)了IgA 腎病的發(fā)生與發(fā)展。黏膜組織的免疫功能紊亂，尤其是扁桃體，目前被較多研究者作為IgA 腎病發(fā)病機(jī)制研究的重點(diǎn)方向[13]。黏膜免疫功能異常引起如β-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶等糖基化相關(guān)酶類(lèi)及其相關(guān)的伴侶蛋白表達(dá)降低，以及黏膜淋巴B 細(xì)胞產(chǎn)生O-糖鏈糖基化異常的IgA 分子，該異常的IgA 分子沉積在腎小球系膜區(qū)，進(jìn)而導(dǎo)致IgA 腎病的發(fā)生與發(fā)展[14]。在臨床治療中可以觀察到，扁桃體切除術(shù)后，部分IgAN 患者的生活質(zhì)量、尿檢異常、腎功能惡化的進(jìn)展均有所改善，這些研究結(jié)果均提示扁桃體等黏膜組織可能為IgA 腎病的致病抗原產(chǎn)生場(chǎng)所[15，16]。腎間質(zhì)纖維化是所有腎臟疾病慢性化的病理表現(xiàn)，也是影響慢性腎臟病預(yù)后和導(dǎo)致腎功能損害的主要因素之一。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-1β 陽(yáng)性對(duì)照組、CagA 實(shí)驗(yàn)組系膜細(xì)胞外基質(zhì)濃度及mRNA 表達(dá)水平高于空白對(duì)照組（P＜0.05），提示CagA 可以在體外誘導(dǎo)大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)異常分泌，在蛋白與mRNA 層面均提高了CollagenⅠ、CollagenⅢ的表達(dá)，同IL-1β陽(yáng)性對(duì)照具有相似作用。CagA 作為幽門(mén)螺桿菌（Hp）主要的毒力蛋白之一，在消化性潰瘍等胃腸道疾病以及Hp 感染方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，其主要機(jī)制為CagA 可以導(dǎo)致胃上皮細(xì)胞的破壞、黏膜損傷、組織炎癥甚至腫瘤發(fā)生。在Hp 感染與IgAN 的相關(guān)研究中，IgAN 患者的腎小球系膜區(qū)可見(jiàn)Hp 以及相關(guān)的免疫復(fù)合物沉積[17]。腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)分泌的增加是IgAN 的基本組織學(xué)改變。CagA 具有促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)分泌的作用[18]。因此，當(dāng)腎小球受到炎癥或如同CagA 等因素作用時(shí)，可刺激系膜細(xì)胞增殖，分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原，致ECM 大量堆積，并分泌多種細(xì)胞因子、層粘蛋白等，更進(jìn)一步介導(dǎo)腎臟免疫、炎癥反應(yīng)，加重腎臟損傷。

黃芪具有益氣補(bǔ)腎、活血化淤的功效，在臨床治療中有提高血漿白蛋白、減輕腎損害的作用，且藥理學(xué)研究表明[19]，黃芪及其黃芪皂苷可以通過(guò)各種機(jī)制參與對(duì)腎臟的保護(hù)，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。黃芪苷Ⅳ可以減少單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）小鼠模型的細(xì)胞外基質(zhì)分泌以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并通過(guò)TLR4/NF-кB 調(diào)控改善腎間質(zhì)纖維化[20]。黃芪甲苷通過(guò)miR-98-5p 抑制小兒IgAN 中半乳糖缺乏的IgA1 分泌，參與對(duì)IgAN 的保護(hù)作用[21]。在糖尿病腎病中，黃芪可以顯著抑制腎皮質(zhì)NLRP3、Caspase-1和IL-1β 的表達(dá)水平，降低血清腫瘤壞死因子-α 和單核細(xì)胞趨化蛋白-1 的水平。在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中，黃芪顯著提高NLRP3、Pro-Caspase-1 和Caspase-1 的表達(dá)水平，表明黃芪可以通過(guò)抗NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的炎癥改善了db/db 小鼠的腎功能和足細(xì)胞損傷，并延遲了糖尿病腎病的發(fā)展[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CagA+黃芪干預(yù)組細(xì)胞外基質(zhì)濃度及mRNA 表達(dá)水平低于CagA 實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），提示黃芪干預(yù)可抑制CagA 誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)的異常分泌，無(wú)論從CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白或者mRNA 表達(dá)水平都起到了抑制作用。

綜上所述，黃芪或通過(guò)降低Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)水平，抑制CagA 誘導(dǎo)異常分泌的大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)，從而可為臨床上IgAN 的治療提供新思路。本研究尚存在較多不足，黃芪可能通過(guò)抑制腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)增多而減緩IgA 腎病進(jìn)程，然而，在人體內(nèi)是否有類(lèi)似作用還需要進(jìn)一步通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。此外，參與調(diào)控黃芪對(duì)系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)異常分泌的抑制信號(hào)通路需進(jìn)一步研究。