LncRNA 作為ceRNA 調控miRNA 在NSCLC 中的作用

郭居斗，杜振宗，宋劍非

（1.桂林醫學院臨床醫學系，廣西 桂林 541199；2.廣西壯族自治區南溪山醫院胸外科，廣西 桂林 541002；3.桂林醫學院附屬醫院胸外科，廣西 桂林 541001）

在我國，肺癌的發病率、死亡率已躍居第1 位，成為導致腫瘤患者死亡的主要疾病[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數的80%～85%，其病情發展迅速，轉移速度快，復發率較高，很多患者發現時已發展至中晚期，預后差。早期接受治療的NSCLC 患者復發率較高，且70%以上患者被發現時已是局部侵犯或遠隔轉移而無法手術[2]。因此治療非小細胞肺癌已經成為臨床治療的難點，為提升患者的治療效果和延長生存時間，探索新型治療模式具有非常重要的臨床意義。lncRNA一段長度超過200 bp 具有一定功能的非編碼RNA，lncRNA 參與腫瘤過程并且通過多種模式，包括染色質重塑、轉錄調控、選擇性剪接、miRNA 競爭性吸附、mRNA 穩定調控、調控蛋白質的翻譯、降解、結構與功能[3]。miRNA 是一段編碼少于20 bp 廣泛存在于生物體內的非編碼RNA 分子，在調控基因表達過程中起著重要作用，它們與DNA 轉錄出來的mRNA 中3'-UTR 相結合，從而導致mRNA 的翻譯受到抑制[4]。近年來，競爭性內源性RNA（ceRNA）作為一種新興的研究模式，在腫瘤發生機制及進展等方面扮演重要角色，尤其是在非小細胞肺癌的研究中。lncRNA 可以通過ceRNA 活性發揮miRNA 海綿作用，進而調節腫瘤的進程。本文主要就近年lncRNA 作為ceRNA 調控miRNA 機制在非小細胞肺癌中的研究進行綜述，旨在闡明這種新的RNA 作用模式將導致對基因調控網絡的新的認識，以期為肺癌的治療提供新靶點、新途徑。

1 lncRNA 作為ceRNA 調控miRNA 的機制

2011 年Salmena 首次提出了ceRNA 假說，即LncRNA 可以通過miRNA 中的反應元件（microRNAs response elements，MREs）與mRNA 競爭性結合miRNA 來調節下游基因的表達，該假說鞏固了轉錄本并構成了一個調控RNA 網絡，ceRNA 可以作為miRNA 的海綿，并在功能上阻止這些靶向轉錄的mRNA 被miRNA 降解[5]。lncRNA 通過競爭性結合miRNA 而起到競爭內源性RNA 的作用，作為海綿一樣緩沖并抑制其下游相關基因的表達，從而發揮“miRNA-sponges”的功能[6]。因此，lncRNA 具有其獨特而又多樣的功能，使之成為天然的miRNA 海綿發揮ceRNA 作用，成為在抗腫瘤或促腫瘤過程中不可缺少的一員。

2 lncRNA 作為ceRNA 調控miRNA 促進非小細胞肺癌進展

2.1 lncRNA NORAD DNA 損傷激活的非編碼RNA（non-coding RNA activated by DNA damage，NORAD）是一種特殊的非編碼RNA，調節基因組穩定性，與其他lncRNAs 相比，NORAD 高度保守。NORAD 最初被認為是Chr20q11.23 的外顯子編碼轉錄本，在胰腺癌和骨肉瘤中被發現上調，因此它被確定為一種癌基因，并與各種癌癥的不良預后相關[7]。NORAD 作為ceRNA，通過miRNA 調節不同癌癥的下游機制。Wan Y 等[8]研究發現，NORAD 在非小細胞肺癌組織中高表達，在體內外均能促進非小細胞肺癌的生長和轉移。與正常細胞相比，miR-520a-3p在腫瘤細胞中的表達顯著降低。通過數據庫篩選出miR-520a-3p 為NORAD 的靶基因，熒光素酶結果表明NORAD 通過靶向NORAD 基因的3'UTR 調節其表達。此外，野生型NORAD WT 可降低A549 細胞中miR-520-3p 的表達，而NORAD 敲除A549 細胞中上調miR-520-3p 的水平。該研究結果表明，lncRNA NORAD 可能與miR-520a-3p 結合，并且NORAD 可以作為ceRNA 來調節miR-520a-3p，從而影響PI3k/Akt/mTOR 信號通路，促進非小細胞肺癌的進展[8]。近年來，上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal tansition，EMT）成為包括肺癌在內的惡性腫瘤基礎研究的熱點，腫瘤細胞發生EMT 后侵襲性明顯增強，更容易發生轉移。研究表明[9]，EMT 過程中伴隨著上皮細胞分子標志物E-鈣粘蛋白（Ecadherin）的表達減少和間質細胞分子標記物N-鈣粘蛋白（N-cadherin）的表達增加，腫瘤細胞向間充質細胞形態發生變化，能動性和侵襲能力顯著增強，具有明顯的間充質細胞的特性。Chen Z 等[10]研究發現，lncRNA NORAD 通過吸附miR-422a 在非小細胞肺癌中發揮促癌作用，NORAD 通過下調miR-422a 促進非小細胞肺癌發生EMT 過程，增加Ncadherin 的蛋白表達水平，并顯著降低了E-cadherin 的表達水平，從而促進非小細胞肺癌的遷移與侵襲。

2.2 lncRNA DANCR 位于4 號染色體上的分化拮抗非蛋白編碼RNA（differentiation antagonizing nonprotein coding RNA，DANCR）是一種有價值的腫瘤相關lncRNA，其表達失調見于多種惡性腫瘤，包括肝細胞癌[11]、乳腺癌[12]、結直腸癌[13]、胃癌[14]和肺癌[15]。DANCR 的異常表達已被證明可促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其可能作為一種有用的疾病生物標志物或治療癌癥的靶點[16]。Huang YF 等[17]研究發現，DANCR 在體內和體外可顯著增加非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。根據ceRNA 假說，采用StarBase 和TargetScan 預測，miR-758-3p 被確定為DANCR 的下游，實時定量PCR 顯示非小細胞肺癌細胞中miR-758-3p 的表達受DANCR 控制。此外，集落形成和侵襲實驗表明DANCR/miR-758-3p 軸對非小細胞肺癌的發生有顯著影響。綜上所述，lncRNA DANCR 在非小細胞肺癌中作為腫瘤啟動子發揮作用，它通過直接靶向腫瘤抑制因子miR-758-3p 促進細胞增殖、侵襲和遷移[18]。Bai Y 等[19]的研究發現，DANCR 可以吸附miR-138 以促進非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，說明miR-138是DANCR 的抑制靶點。此外，該研究還顯示，DANCR 通過競爭性結合miR-138 發揮Sry 相關高遷移率族盒4（Sry-related high-mobility group box 4，Sox4）基因的ceRNA 的作用，而miR-138 的過度表達或Sox4 的敲除并不能完全消除DANCR 過度表達增加的增殖、遷移和侵襲；熒光素酶和芯片分析的結果表明，轉錄因子Sox4 可以結合到DANCR 基因的啟動子區域，激活其轉錄。因此推測DANCR 通過充當ceRNA 上調SOX4 的表達，而Sox4 可反向觸發DANCR 轉錄，揭示了lncRNA DANCR 和Sox4之間的正反饋調節回路。

2.3 lncRNA SNHG6 小核仁RNA 宿主基因6（Small nucleolar RNA host gene 6，SNHG6）是人類5’TOP家族的管家基因，SNHG6 位于染色體8q13 上，SNHG6 通過一些癌細胞（如肝細胞和結直腸癌細胞）的細胞質和核RNA 部分優先定位于細胞質中[20，21]。根據最近的研究，與相應的非癌組織以及不同的癌細胞系相比，SNHG6 在癌組織中過度表達，SNHG6 上調與患者的晚期腫瘤進展和短期生存有關[22]。Li K 等[23]研究發現SNHG6 的表達增加與病理分期和淋巴結浸潤有關，并作為非小細胞肺癌患者腫瘤復發的獨立預后因素；沉默SNHG6 的表達可抑制細胞生長和侵襲，SNHG6 還可以與miR-101-3p 結合并負調節miR-101-3p 的表達；因此，SNHG6 可能作為miR-101-3p 的海綿來調節染色質Y 樣（Chromodomain Y-like，CDYL）基因的表達，進而促進非小細胞肺癌細胞生長。在Dong Z 等[24]的研究中表明，SNHG6 顯著促進非小細胞肺癌細胞的增殖并抑制其凋亡，其中SNHG6、重塑和間隔因子1（remodeling and spacing factor 1，RSF1）基因的表達上調，而在非小細胞肺癌腫瘤和細胞中miR-490-3p的表達下調，miR-490-3p 表達與SNHG6 或RSF1表達呈負相關。隨后的熒光素酶報告分析驗證了miR-490-3p 與SNHG6 或RSF1 之間的相互作用。更重要的是，SNHG6 基因敲除減緩了細胞生長，然而miR-490-3p 抑制劑取消了SNHG6 沉默誘導的對生存能力的抑制和對凋亡的促進。而RSF1 恢復了SNHG6 沉默介導的增殖抑制和凋亡加速。體內實驗表明，SNHG6 基因敲除通過抑制RSF1 促進細胞凋亡來抑制腫瘤生長。

2.4 lncRNA XIST X 滅活特異性轉錄本（X inactivate-specific transcript，XIST）是在哺乳動物中發現的首批lncRNAs 之一，是雌性哺乳動物X 染色體轉錄沉默所必需的，在順式染色體中包裹X 染色體，并在X 染色體失活（X chromosome inactivation，XCI）中發揮重要作用。最近的研究表明，XIST 在多種腫瘤中顯著上調，XIST 基因敲除可下調增殖和侵襲相關蛋白，包括增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、重組細胞周期蛋白D1（recombinant cyclin D1，CCND1）和基質金屬肽酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）[25]。Jiang Q 等[26]的研究發現，XIST 在非小細胞肺癌中升高，miR-142-5p 是XIST 的靶點，沉默miR-142-5p 可逆轉非小細胞肺癌細胞中XIST 基因敲除介導的抗腫瘤功能，配對盒6（Paired box 6，PAX6）基因被證實是miR142-5p 的靶點，PAX6 的過度表達減弱了miR-142-5p 恢復對非小細胞肺癌細胞惡性表型的抑制作用，而且XIST 可通過在體內和體外吸附miR-142-5p 間接調節PAX6 的表達。因此，lncRNA XIST通過調節miR-1425p/PAX6 軸促使人非小細胞肺癌的細胞致瘤性。轉化生長因子β（Transforming growth factorβ，TGF-β）介導的EMT 過程是腫瘤細胞遷移和侵襲的主要機制之一[27]。Li C 等[28]研究觀察到轉移性非小細胞肺癌組織中lncRNA-XIST 和鋅指因子（ZEB2）的表達增加，敲除lncRNA-XIST可抑制ZEB2 的表達，還可抑制TGF-β 誘導的EMT和非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲。這些結果表明，lncRNA-XIST 對TGF-β 誘導的EMT 的作用可能在一定程度上依賴于ZEB2 的表達，生物信息學分析預測ZEB2 是miR-367 和miR-141 的靶點，熒光素酶報告基因分析在轉染miR-367 或miR-141 的非小細胞肺癌細胞中評估的結果驗證了該預測。Li C等[28]研究還發現，lncRNA-XIST 分別與miR-367 和miR-141 存在相互抑制，該結論支持lncRNA-XIST通過調節非小細胞肺癌細胞中的miR-367/miR-141-ZEB2 軸在EMT 誘導中的作用。

3 lncRNA 作為ceRNA 調控miRNA 抑制非小細胞肺癌進展

3.1 lncRNA MEG3 母源表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）是位于染色體14q32.3 上的長鏈非編碼RNA。研究發現，在多種癌癥中起作用的lncRNA MEG3 在非小細胞肺癌中低表達并與不良預后有關[29]。Lv D 等[30]的研究表明，過表達的lncRNA MEG3 可抑制miR-21-5p 表達水平，MEG3通過充當miR-21-5p 海綿抑制H1299 細胞的遷移和侵襲，磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）通過負性調節PI3K/AKT 信號通路發揮腫瘤抑制作用，其中PTEN 是miR-21-5p 的直接靶點，MEG3 過度表達導致PTEN 表達水平增加，miR-21-5p 可降低PTEN 表達水平，MEG3通過吸附miR-21-5p 來上調PTEN 的表達水平，隨后減弱PI3K/AKT 信號通路，從而抑制非小細胞肺癌H1299 細胞的遷移和侵襲。腫瘤細胞的衰老是重要的抑癌機制[31]。Tao Y 等[32]研究了MEG3 在腫瘤細胞衰老過程中的作用及其通過與miR-16-5p 競爭結合調節編碼退化樣家族成員4（encoding vestigial like family member 4，VGLL4）表達的潛在分子機制。該研究采用依托泊苷構建腫瘤細胞衰老模型，檢測lncRNA MEG3、miR-16-5p 和VGLL4 在衰老或非衰老細胞中的表達，雙熒光素酶報告基因檢測miR-16-5p、lncRNA MEG3 和VGLL4 的結合，使用蛋白質印跡檢測衰老相關標志物（p21 和p16）的mRNA和蛋白質表達水平，結果顯示與對照組相比，MEG3和VGLL4 在衰老細胞中的表達顯著上調，MEG3 和VGLL4 的敲低降低了衰老程度以及p21 和p16 的表達，MEG3 通過競爭性結合抑制衰老A549 細胞中miR-16-5p 的表達，VGLL4 的表達受miR-16-5p 在衰老A549 細胞中的調控，MEG3 通過miR-16-5p/VGLL4 軸參與依托泊苷誘導的腫瘤細胞衰老進程。Wu JL 等[33]研究表明，lncRNA MEG3、乳腺癌1 號基因（Breast Cancer No.1 gene，BRCA1）在非小細胞肺癌組織和A549 細胞系中的表達顯著低于正常組，lncRNA MEG3 和BRCA1 在A549 細胞系中的過表達導致肺癌細胞凋亡增加。雙熒光素酶報告基因檢測表明，MEG3 可以通過競爭性結合miR-7-5p 形成lncRNA MEG3/miR-7-5p/BRCA1 調控網絡來調節BRCA1 的表達。總之，lncRNA MEG3 在非小細胞肺癌中顯著下調，它可以通過與miR-7-5p 競爭性結合來調節BRCA1 的表達。

3.2 lncRNA GAS5 生長停滯特異性轉錄本5（Growth arrest-specific transcript 5，GAS5）最早從NIH3T3 細胞中分離出來，位于染色體1q25，長度約630 nt，GAS5 通過促進多種細胞的生長阻滯和凋亡而發揮抑癌作用[34]。研究發現[35]，它通過抑制糖皮質激素介導的幾種應答基因的誘導，在細胞中積聚并使細胞對凋亡敏感。除了調節多種癌細胞的增殖、侵襲和轉移外，GAS5 下調也被認為是癌癥化療耐藥的主要調節因子[36]。Chen L 等[35]的研究檢測了3個可能是GAS5 靶點的miRNA 的表達，發現lncRNA GAS5 照射A549 細胞后，只有miR-21 受到影響，結果表明，雖然GAS5 過表達在正常情況下可以下調miR-21 的水平，但在電離輻射（ionizing radiation，IR）時這種抑制作用明顯增強，表明GAS5 與miR-21 之間的相互作用可能是一種IR 特異性反應。PTEN 是PI3K/Akt 信號通路的抑制劑，PTEN/Akt軸是IR 誘導細胞凋亡的關鍵調控通路。該研究還發現miR-21 在PTEN 3'UTR 上有潛在的結合位點，GAS5 過表達或抑制miR-21 可使PTEN 水平升高，Akt 磷酸化水平降低，尤其是在IR 過程中，這說明lncRNA GAS5 通過競爭內源性調節miR-21，進而靶向到PTEN/Akt 通路，增強了A549 細胞的放射敏感性。該研究揭示了lncRNA GAS5 與非小細胞肺癌明顯的放射敏感性相關，在臨床放射治療中作為放射增敏劑或放射敏感性指標有很大的潛力。磷酸賴氨酸磷酸組氨酸無機焦磷酸磷酸酶（phospholysinephosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase，LHPP）可能會降低非小細胞肺癌的耐藥能力，LHPP 首次從豬腦組織中分離出來，可抑制人肝癌和宮頸癌[37，38]。Yang X 等[39]的研究證實，GAS5 在非小細胞肺癌組織和順鉑（DDP）耐藥非小細胞肺癌細胞系中表達減少，且GAS5 表達增加與非小細胞肺癌患者的臨床病理特征呈負相關，GAS5 通過抑制EMT 進展來抑制順鉑耐藥非小細胞肺癌細胞的轉移，GAS5 在體內抑制非小細胞肺癌/DDP 腫瘤的生長，GAS5 作為miR-217 的ceRNA 提高了順鉑耐藥非小細胞肺癌細胞系中LHPP 的表達水平，從而抑制非小細胞肺癌順鉑耐藥、轉移和EMT 進展。

4 總結

ceRNA 介導的基因之間相互調控是一種新興的研究領域，使人們對疾病尤其是腫瘤的探索中有了全新的認識。隨著生物信息學分析技術的高速發展，lncRNA 作為ceRNA 調控miRNA 在非小細胞肺癌中的機制研究得到深入，未來會有更多種lncRNA與miRNA 被篩選出來，彼此形成ceRNA 調節網絡，共同參與到肺癌的發病機制、診斷，為肺癌的診斷治療提供新方法。