國產兩性霉素B脂質體對侵襲性真菌病病原菌體外抗菌活性的研究

康巍，張戈，張京家，段思蒙，王瞳，李進，皇甫芷如，徐英春，張麗

中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科，侵襲性真菌病機制研究與精準診斷北京市重點實驗室，北京 100730

兩性霉素 Ba（amphotericin B ，AmB）是一種大環多烯類抗菌藥物，因其能特異地與真菌細胞膜上麥角固醇結合而用于抗真菌治療[1]。AmB對大多數侵襲性真菌，包括酵母菌和絲狀真菌均具有良好的體外活性。AmB自 1959 年上市以來，在侵襲性真菌感染臨床治療中發揮著重要作用[2]。

AmB普通制劑，即AmB脫氧膽酸鹽（amphotericin B deoxycholate，AmBD），因其具有治療劑量依賴性、腎毒性和輸注相關的不良反應，大大地限制了其臨床應用。基于AmB所研制的商業配方AmB的脂質體制劑，已被證明可以降低AmB的不良反應，同時保持藥物的活性[3]。目前，市面上廣泛應用的AmB脂質體制劑有以AmBisome為代表的AmB脂質體（liposomal amphotericin B，L～AmB）、以Abelcet為代表的AmB脂質復合物（amphotericin B lipid complex，ABLC）和以Amphocil/Amphotec為代表的AmB膠體分散體（amphotericin B colloidal dispersion，ABCD）3種劑型。3種AmB脂質體制劑均含有AmB，但在脂質組成、形狀、大小、穩定性、藥動學和毒性方面存在差異，這些差異可能會影響各種制劑的治療用途[4]。

本研究所用注射用AmB脂質體均為L～AmB劑型。通過對比分析國產、進口注射用L～AmB制劑、注射用AmBD制劑與AmB標準品對常見念珠菌以及絲狀真菌的體外藥物敏感性；評估4種AmB制劑體外抗真菌活性的差異；觀察4種AmB制劑對侵襲性真菌的體外藥物敏感性，為臨床抗真菌治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究選取中國醫院侵襲性真菌病監測網（CHIF～NET）2018年收集的菌株，均分離自患者血液、組織、引流液、導管等無菌部位。納入15種酵母菌（317株），其中白念珠菌 44 株、熱帶念珠菌 43 株、光滑念珠菌 43 株、近平滑念珠菌43 株、克柔念珠菌 29 株、隱球菌37株、希木龍念珠菌9株、葡萄牙念珠菌19株，及其他臨床少見酵母菌50株。此外，納入6 種絲狀真菌（76 株），其中煙曲霉 20 株、黃曲霉 12 株、土曲霉 12 株、黑曲霉 10 株、鐮刀菌12 株、構巢曲霉 10 株。質量控制菌株為近平滑念珠菌 ATCC22019，克柔念珠菌 ATCC6258[5]。

1.2 藥品與試劑

國產注射用L～AmB制劑（注射用兩性霉素B脂質體，石藥集團中諾藥業，批號830190703）；進口注射用L～AmB制劑（注射用兩性霉素B脂質體，Ambisome，Gilead Science， Inc.，批號 15750）；注射用AmBD制劑（注射用兩性霉素B，商品名：歐泊，華北制藥股份有限公司，國藥準字H13020285，批號FFLD190701）；AmB 標準品（歐洲藥品質量管理局，批號Y0000005）。

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma公司）；聚山梨酯 20（Solarbio公司）；0.9%氯化鈉溶液（華潤雙鶴藥業股份有限公司）；科馬嘉顯色培養基（法國科馬嘉公司）；沙保弱培養基（英國 Oxoid 公司）；RPMI1640 培養基（德國Sigma～Aldrich 公司），含谷氨酰胺不含碳酸氫鹽并以酚紅為指示劑，使用 0.165 mol/L MOPS 緩沖液（MOPS Buffer）調 pH（ 7.0±0.1)。

1.3 儀器

無菌U型96孔板（江蘇省海門盛泰實驗器材廠）； Sentititre AIM全自動加樣儀（賽默飛世爾科技公司）；VITEK MS基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI～TOF～MS，法國生物梅里埃公司）；恒溫培養箱（賽默飛世爾科技公司）；比濁儀（法國生物梅里埃公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 微量肉湯稀釋法藥敏試驗

按照美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M27～ED4 與 M38～ED3 文件嚴格操作[6～7]。測試藥物包括 AmB 標準品（0.03～16μg/ml）、進口注射用 L～AmB 制劑（0.03～16μg/ml）、國產注射用L～AmB制劑（0.03～16μg/ml）、注射用AmBD制劑（0.03～16μg/ml）。按照溶解性分別采用DMSO或純化水溶解抗真菌藥物，獲得相應濃度的儲存液。使用RPMI1640培養基將儲存液依次對比稀釋至相應濃度并加入96孔板中，每孔100μl。

多數絲狀真菌在沙堡弱培養基中于 35℃條件下孵育48h，直至形成良好的孢子；鐮刀菌屬在 35℃條件下孵育48～72h后，在 25℃條件下孵育至第7天；所有的酵母菌均在沙堡弱培養基中傳代2次，均在35℃條件下孵育48h以確保菌株純度和存活率。入組菌株均使用MALDI～TOF～MS進行細菌鑒定。

酵母菌用無菌0.9%氯化鈉溶液洗脫，使用比濁儀調制成0.5麥氏濁度，加入 RPMI 1640 培養基繼續稀釋 1000倍，使接種終濃度達到 0.5×103～ 2.5×103菌落形成單位（CFU）/ml。使用含 0.1%聚山梨酯20的0.9%氯化鈉溶液將絲狀真菌調制成較濃的懸濁液，待菌絲靜置沉降后，吸取上清液調制成 0.5 麥氏濁度，加入 RPMI 1640培養基進一步稀釋 50 倍，使接種終濃度達到 0.4×104～5×104CFU/ml。

按照濃度由高到低將上述真菌的 RPMI1640 培養基依次加入藥敏板（96孔板）中，置于35℃條件下培養。待念珠菌孵育24h，毛孢子菌與絲狀真菌孵育48h，隱球菌孵育72h后，讀取藥敏試驗結果。與生長對照孔相比，各AmB制劑及標準品讀取100%抑制的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。

每批測試中，均使用質量控制菌株近平滑念珠菌 ATCC22019，克柔念珠菌 ATCC6258監控實驗質量，保證測試MIC的準確性。

1.4.2 數據分析方法

采用WHONET 5.6軟件進行數據分析。根據MIC 值統計MIC范圍、MIC50、MIC90和幾何平均數（geometric mean，GM），比較4種AmB制劑體外藥敏差異。計算國產與進口L～AmB制劑之間的基本一致性（essential agreement， EA）。EA指被待測藥物檢測 MIC 值與參考藥物相差不超過 1 個稀釋倍數。

2 結果

每批測試中，質量控制菌株的MIC值均在質控范圍內。

表1總結了不同AmB制劑及標準品對 317 株酵母菌的MIC范圍、MIC50、MIC90、GM以及脂質體制劑間的EA。結果提示，4種AmB制劑對多數臨床常見念珠菌和隱球菌的MIC50和MIC90值均≤2μg/ml；2種注射用L～AmB 制劑對希木龍念珠菌的MIC50和MIC90值分別為8μg/ml和16μg/ml；AmB標準品和進口注射用L～AmB制劑對部分臨床少見念珠菌的MIC50和MIC90值為4μg/ml；商品制劑（注射用AmBD制劑以及2種注射用L～AmB制劑）對所測試的多數念珠菌活性均比AmB標準品的MIC低；但4種AmB制劑對隱球菌以及部分臨床少見念珠菌的MIC分布相近。

表1 4種AmB制劑對酵母菌的體外敏感性差異 n=317

續表

續表

表2總結了不同AmB制劑及標準品對76株絲狀真菌的MIC 范圍、MIC50、MIC90、GM以及L～AmB制劑之間的EA。結果提示，4種AmB制劑對煙曲霉、黃曲霉和黑曲霉的MIC50和MIC90值均≤1μg/ml。與酵母菌相似的是，商品制劑（注射用AmBD制劑以及2種注射用L～AmB制劑）對所測試的多數菌種活性均比AmB標準品MIC低。但在部分土曲霉、鐮刀菌和構巢曲霉中，L～AmB制劑的活性比標準品及AmBD制劑高出3～4個稀釋倍數。2種L～AmB制劑對土曲霉、鐮刀菌和構巢曲霉的MIC90值均為16μg/ml。

表2 4種AmB制劑對絲狀真菌的體外藥物敏感性差異 n=76

續表

在測試的4種AmB制劑中，多數情況下國產注射用L～AmB制劑MIC較低，而AmB標準品MIC偏高。2種非脂質體制劑MIC分布相近，2種L～AmB制劑對于大多數菌種的EA均為100%，僅有 1 株熱帶念珠菌與 2 株近平滑念珠菌的國產L～AmB制劑比進口L～AmB制劑MIC 值低 2 個稀釋倍數，2種L～AmB制劑對于熱帶念珠菌和近平滑念珠菌的EA分別為98%和95%。

3 討論

AmB自上市以來，一直以良好的抗真菌活性應用于臨床的抗真菌治療中。一項體外藥物敏感性研究發現[8]，AmB對該研究納入的毛霉、根霉等26株毛霉菌目真菌的MIC值均＜2μg/ml，伏立康唑的MIC值均＞4μg/ml，提示目前AmB仍具有良好的抗真菌活性。但AmB的腎毒性和輸注相關反應同樣限制了其在臨床治療中的應用，而AmB脂質體相較于普通AmB注射制劑，可大大降低腎毒性等不良反應。多項臨床研究表明[9～11]，應用AmB脂質體對患者進行抗真菌治療，其腎毒性和輸注相關反應等的不良事件發生率低于普通注射劑型，可使真菌感染患者獲得更好的臨床治療效果。自20世紀90年代AmB脂質體制劑被研制出并成功上市，AmBisome等脂質體制劑在臨床實踐中廣泛應用，但其治療費用較高。目前，國產AmB脂質體的陸續上市將給患者帶來更多臨床獲益。

本研究中AmB標準品在多數菌種中抗菌活性較3種商品試劑MIC偏高，其原因可能為AmB容易受到光照、溫度等環境因素影響。通過添加脫氧膽酸鈉（增溶劑）或抗氧化劑以及使用脂質體包裹等方式，使商品制劑中的AmB較標準品在相同的環境下可以更好地保持藥物穩定性以及抗菌活性[12]。

在既往研究中[13～16]，使用不同的AmB脂質體制劑進行體外抗真菌活性研究，發現部分菌株中其體外藥物活性弱于非脂質體制劑，其可能與受到體外環境下脂質體制劑釋放AmB限制有關。既往研究表明ABLC制劑釋放活性AmB受到所接觸細胞釋放的磷脂酶的影響[14]。Swenson 等[14]研究證實了某些酵母菌可產生足夠的磷脂酶可幫助ABLC制劑釋放AmB，以達到殺菌目的。由于部分真菌自身分泌不足，導致其體外藥物敏感性較低。在培養基中添加磷脂酶可以恢復ABLC制劑的抗真菌活性。研究還指出，某些在體外對 ABLC制劑耐藥而對AmB敏感的曲霉屬分離株在小鼠體內模型中仍表現敏感[14]。

ABLC與L～AmB同為兩性霉素B的脂質體制劑，其中ABLC為由二聚糖基磷脂酰膽堿和二聚糖基磷脂酰甘油混合物構成的帶狀結構，其粒徑在1600～11 000nm之間。而 L～AmB由氫化大豆磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰基～磷脂酰甘油和AmB組成的球形單層脂質體，其平均直徑＜100nm。二者雖然在脂質組成、形狀、大小等方面有所不同，但抗真菌活性成份AmB均被脂質體完全包裹，以此減少其在人體內的不良反應[17]。因此，提示將AmB完全包裹的方式可能導致體外AmB釋放速率不足，進而導致體外抗真菌活性減弱。目前，尚未見明確L～AmB制劑是否與ABLC制劑同樣依賴于磷脂酶釋放的報道，未來仍有待進一步研究。

綜上所述，本研究中國產注射用L～AmB制劑與進口注射用L～AmB制劑的體外活性較為一致。此外，國產注射用L～AmB制劑體外藥物敏感性較好，具有良好的抗真菌活性。但由于體外未知因素可能會影響其內部AmB藥物的釋放，導致體外實驗不能準確地反映其對不同真菌菌種的藥物活性情況，未來還需開展動物實驗及臨床對照試驗等研究，以進一步評估國產注射用L～AmB制劑的臨床治療價值。