TcYellow-h基因過表達參與介導赤擬谷盜對磷化氫的抗性形成

陳二虎，孟宏杰，陳 艷，宋 偉，唐培安

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心；江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023)

赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)隸屬鞘翅目，擬步甲科，擬谷盜屬，是一種全球廣泛分布的重要儲糧害蟲，在我國大部分地區均有發生，嚴重危害玉米、稻谷、小麥、大豆以及薯干、酒曲、豆餅、藥材、油菜等[1]。赤擬谷盜具有食性復雜、繁殖能力強、分泌有毒物質等特點，在農產品儲運過程中一旦局部發生便會造成嚴重經濟損失[2]。磷化氫(PH3)是儲糧害蟲防治的重要熏蒸劑，由于長期施用，已導致赤擬谷盜、銹赤扁谷盜(Cryptolestesferrugineus)、谷蠹(Rhyzoperthadominica)等害蟲對其產生不同程度抗藥性[3-5]，影響了糧食倉儲[6]。因此，開展磷化氫抗性機制研究，避免和延緩磷化氫抗性發展，對磷化氫的可持續利用具有參考價值。磷化氫可通過呼吸作用進入昆蟲體內，進而降低線粒體膜電位，抑制氧化呼吸反應，引起蟲體內活性氧(ROS)水平顯著提升，導致氧化損傷，最終造成昆蟲死亡[7]。因此，可通過控制昆蟲線粒體及呼吸代謝相關基因的表達水平來降低呼吸速率，進而減少熏蒸劑的吸收[8]。已有研究發現赤擬谷盜和谷蠹磷化氫抗性品系的呼吸速率顯著低于敏感品系[9, 10]，線粒體重要的二聚體酶二氫硫辛酰胺脫氫酶基因突變已被證實參與介導谷蠹和赤擬谷盜對磷化氫高水平抗性的形成[11]。此外，研究發現眾多解毒代謝相關基因，包括細胞色素P450、羧酸酯酶(Carboxylesterases)、谷胱甘肽硫轉移酶(Glutathione S-transferases)等均在儲糧害蟲磷化氫抗性品系中顯著高表達[12-15]。本課題組前期研究結果顯示P450酶活性的提高參與介導赤擬谷盜磷化氫抗性，進一步干擾過表達的P450基因，昆蟲對磷化氫敏感性顯著增強，證實解毒代謝反應亦參與儲糧害蟲磷化氫抗性形成[14, 15]。昆蟲表皮覆蓋于蟲體外表面，具有承擔外骨骼的功能，起防御外界不良環境如病原體、殺蟲劑等侵襲的作用，是昆蟲適應復雜自然環境的重要保護器官[16]。昆蟲可通過改變表皮結構和成分，降低表皮穿透性來阻止或減少殺蟲劑進入蟲體，進而形成抗藥性，因此表皮穿透性是昆蟲抗藥性形成的機制之一[17]，其是否參與磷化氫抗性形成鮮見報道。研究人員已通過高通量轉錄組測序發現表皮相關基因TcYellow-h在赤擬谷盜磷化氫抗性品系中顯著高表達，預示其可能與磷化氫抗性相關[12]。本實驗以危害嚴重且抗性發展迅速的儲糧害蟲赤擬谷盜為研究對象，綜合運用生物測定、RT-qPCR、RNA干擾等技術明確昆蟲磷化氫抗性與表皮相關基因的關系，進而為儲糧害蟲的抗性治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

選用5個不同地理種群的赤擬谷盜，分別采自江蘇(JS，抗性倍數為1.7)、云南(YN，抗性倍數為3.0)、湖南(HN，抗性倍數為20.2)、四川(SC，抗性倍數為395.4)和廣東(GD，抗性倍數為862.7)，并在南京財經大學糧食儲運研究室培養數代并形成穩定的實驗室種群。在實驗室內以人工飼料(全麥粉∶酵母粉=19∶1)，在恒溫(29～31) ℃、相對濕度為70%～80%、無光照的恒溫恒濕培養箱中飼養。

1.2 生物信息學分析

從Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得赤擬谷盜表皮相關基因TcYellow-h(LOC660892)的核苷酸序列，用NCBI的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html)預測該基因的完整開放閱讀框(ORF)。分別使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)在線軟件預測TcYellow-h蛋白的信號肽及保守的特征序列。

1.3 不同組織基因表達模式分析

不同組織樣本收集，在冰上解剖羽化后7日齡的赤擬谷盜成蟲30頭(江蘇種群為試蟲)，分別在加有Trizol的無菌離心管中收集足量的不同組織部位表皮(頭、胸、腹)、翅、足、腸道、馬氏管、脂肪體，并置于液氮中冷凍保存備用。每個樣本均設3個生物學重復。參照Trizol試劑說明書提取樣品的總RNA(RNA濃度約為500～600 ng/μL)，接著利用RQ1 Rnase-Free Dnase去除基因組DNA。用核酸濃度測定儀測定RNA的濃度和純度，并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶情況，以便進行后續實驗。以RNA為模板(約1 000 ng)，依據HiScript?ⅡstStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)試劑盒說明書進行反轉錄合成第一鏈cDNA，并于-20 ℃冰箱中保存備用。

根據1.3節中獲得的序列信息，利用Primer-Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)設計赤擬谷盜TcYellow-h的特異性RT-qPCR引物(表1)，同時選擇赤擬谷盜RPS18(XM_968539)和RPL13(XM_969211)作為定量實驗的內參基因[14, 15]。按照ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix (Low Rox Premixed)試劑盒說明書，使用ABI 7500 PCR系統進行RT-qPCR分析。該反應為20 uL體系，包括ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Low Rox Premixed)10 μL，上下游引物各1 μL，Template cDNA 2 μL和RNaes free water 6 μL。RT-qPCR程序包括，95 ℃ 預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，并進行40個循環，最后95 ℃延伸30 s。本實驗共設置3個重復，并基于2-ΔΔCt的方法進行數據分析[18]。RT-qPCR采用單因素方差分析方法，平均值多重比較采用最小顯著差異法(LSD)，柱形圖中不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。

表1 引物序列

1.4 不同地理種群基因的表達模式分析

分別挑取正常飼養條件下不同地理種群(JS、YN、HN、SC和GD)的赤擬谷盜7日齡成蟲5頭，加入Trizol充分研磨，總RNA提取、cDNA合成、RT-qPCR實驗以及數據分析均參照1.3小節，共設置3個重復。

1.5 RNA干擾

根據TcYellow-h的基因序列信息，設計帶有T7啟動子的特異性引物(表1)，并進行PCR擴增，參照T7 RNAi Transciption Kit TR102試劑盒說明書體外合成dsRNA。參照Huang et al(2019)的方法[14]，將200 ng dsRNA注射到赤擬谷盜(廣東種群)蛹內(注射位置為蛹的腹側第1節或者第2節)，以未注射組作為空白對照，注射dsGFP組作為陰性對照，每組試蟲30頭，設置3次重復。注射完畢后，置于培養箱中正常飼養，收集羽化第7天的赤擬谷盜成蟲，并凍存于液氮中備用。參照1.3小節的方法進行總RNA提取、cDNA合成、RT-qPCR實驗以及數據分析，并計算RNA干擾的沉默效率。

將TcYellow-h基因進行有效沉默后，對赤擬谷盜磷化氫敏感性進行檢測。選取各處理組成蟲試蟲(50頭，7日齡)，使用LC30的磷化氫濃度行處理；使用氣密性注射器抽取磷化氫氣體并注入熏蒸瓶內，搖勻后置于培養箱中密閉熏蒸(恒溫29～31 ℃、相對濕度為(70%～80%)。熏蒸20 h，統計試蟲死亡數，連續統計14 d(以毛筆輕碰蟲體尾部，附肢無反應作為死亡判斷標準)，每組實驗3次重復。基因沉默效率及試蟲死亡率均采用單因素方差分析方法，平均值多重比較采用最小顯著差異法(LSD)，柱形圖中不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 赤擬谷盜Tcyellow-h序列分析

根據ORF Finder分析，赤擬谷盜TcYellow-h(GeneBank登錄號：XM_008198277.2)開放閱讀框840 bp，編碼279個氨基酸。SignalP 4.1信號肽預測結果顯示，TcYellow-h不存在信號肽。氨基酸序列分析顯示TcYellow-h在第159～448個氨基酸之間存在保守的major royal jelly protein domains(MRJP, pfam03022)氨基酸區域(圖1)。

圖1 赤擬谷盜TcYellow-h氨基酸序列結構分析

2.2 不同組織表達模式分析

針對TcYellow-h基因，其主要在翅組織中高表達，且與其他組織表達量差異顯著(P<0.05)；在胸和腹部表皮組織和足中表達量相對較低；在腸道、馬氏管、脂肪體中少量表達或幾乎不表達。

2.3 不同地理種群表達量分析

TcYellow-h基因在不同地理種群赤擬谷盜的表達水平顯示該基因表達水平隨赤擬谷盜磷化氫抗性水平的增加呈現上調趨勢，且TcYellow-h基因在極高抗種群(SC和GD)的表達量顯著高于其他種群(P<0.05)。

2.4 基因沉默對赤擬谷盜磷化氫敏感性的影響

利用RNAi技術干擾TcYellow-h基因的表達，以分析該基因與赤擬谷盜磷化氫抗性形成的關系。基因沉默效率檢測結果顯示，dsRNA注射能有效降低目的基因的表達，且dsGFP注射組與空白對照組基因表達量均無顯著差異，dsTcYellow-h注射組基因沉默效率為73.0%。TcYellow-h基因的表達量降低后，極高抗種群(廣東，GD)試蟲對磷化氫的敏感性顯著增強，經磷化氫(LC30)處理后其死亡率較對照組均顯著升高(P< 0.05)。dsTcYellow-h處理組試蟲死亡率較對照組升高了32.22%，空白對照組和dsGFP處理組之間試蟲死亡率均無顯著差異(圖2)。

注：柱形圖表示平均值±標準差，不同字母之間表示顯著性差異(P < 0.05, LSD法)，以dsGFP為陰性對照，以未處理組為空白對照。圖2 赤擬谷盜TcYellow-h基因沉默效率檢測及基因沉默后磷化氫的敏感性變化

3 討論

儲糧害蟲對磷化氫的抗性問題日益嚴重，已經成為制約世界各國糧食儲藏行業健康發展的主要問題之一[6, 19]。目前，美國、澳大利亞、巴西、印度、中國等眾多國家發現赤擬谷盜對磷化氫產生了較高的抗藥性[14, 20-22]。已有研究發現磷化氫可通過呼吸作用進入昆蟲體內，且磷化氫抗性產生與儲糧害蟲呼吸和解毒代謝通路基因相關[7, 10, 11, 13]。磷化氫除通過呼吸作用進入蟲體外，亦可通過擴散作用穿透表皮直接進入蟲體，即當昆蟲呼吸急促時，呼吸作用表現為主要吸收途徑；而當昆蟲呼吸作用逐漸減弱時，表皮穿透作用則上升為主要方式[23]，推測表皮穿透性直接影響昆蟲對磷化氫的吸收，表皮相關基因TcYellow-h與磷化氫抗性形成可能存在聯系。

TcYellow-h擁有典型的MRJP基序，屬于昆蟲yellow家族蛋白，且該家族基因在昆蟲表皮鞣化(骨化和著色)過程中發揮重要作用[24]。赤擬谷盜不同組織表達模式分析顯示，TcYellow-h基因主要在成蟲外周組織高表達，該基因可能在昆蟲表皮中發揮作用。RT-qPCR結果發現TcYellow-h基因表達量隨赤擬谷盜抗性水平的增加而顯著升高，類似地，在銹赤扁谷盜、溫帶臭蟲(Cimexlectularius)、桃蚜(Myzuspersicae)、中華按蚊(Anophelessinensis)、致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)等昆蟲中發現不同種類表皮相關基因在藥劑抗性品系中顯著高表達[25-29]。可見，TcYellow-h是赤擬谷盜表皮重要的結構基因，可能參與了磷化氫抗性的形成。

本實驗利用RNA干擾技術驗證TcYellow-h基因在赤擬谷盜磷化氫抗性形成過程中的作用。結果顯示，當注射該基因的dsRNA后，TcYellow-h基因表達水平顯著降低，且經磷化氫處理后，處理組害蟲的死亡率顯著高于對照組，表明基因干擾后赤擬谷盜對于磷化氫的敏感性顯著增強。昆蟲表皮鞣化反應是一個復雜的胞外過程，對于表皮的硬化和著色至關重要。有效沉默鞣化通路上的關鍵基因，如酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase)、多巴脫羧酶(DOPAdecarboxylase)、漆酶(laccase2)、yellow等基因后，昆蟲表皮的著色、結構和厚度均受到顯著影響[24, 30, 31]，暗示它們存在參與昆蟲對于藥劑表皮穿透抗性形成的潛力[32]。據此，通過本研究可得出表皮相關基因TcYellow-h與赤擬谷盜磷化氫抗性相關。

4 結論

赤擬谷盜表皮相關基因TcYellow-h屬于昆蟲yellow家族基因，且其主要在昆蟲外周組織進行表達；TcYellow-h基因表達量隨赤擬谷盜磷化氫抗性水平增加而顯著升高；干擾TcYellow-h基因后，赤擬谷盜對磷化氫的敏感性顯著增強，說明表皮相關基因可能參與介導赤擬谷盜對磷化氫抗藥性的形成。