不同分子質量水溶性大豆皮膳食纖維的單糖組成、結構、性質研究

吳金祥，李榮麗，吳喆超，戴 煌，畢 潔，張 威，肖安紅

(武漢輕工大學食品科學與工程學院；湖北省農產品加工與轉化重點實驗室；大宗糧油精深加工省部共建教育部重點實驗室，武漢 430023)

膳食纖維作為一種食品原料，有益于控制體重、降低膽固醇、預防糖尿病和高血壓等。膳食纖維的單糖組成、分子質量、結構特征等不同，及其功能特性的差異，會影響其生理活性。劉靜娜等[1]研究分子質量為499、2 750 ku殼聚糖對膽固醇的吸附能力，發現499 ku殼聚糖對膽固醇吸附能力更強。韓晴等[2]研究分子質量為140、2 300 ku水溶性大豆多糖的乳化性和起泡性，發現2 300 ku的功能特性更好。何喜珍等[3]采用DPPH自由基、羥自由基清除法和鐵氰化鉀法研究分子質量為550、347、285、21 ku大豆多糖的抗氧化能力，結果表明，285 ku大豆多糖的抗氧化效果最好，分子質量為21 ku的大豆多糖抗氧化效果最差。可見，膳食纖維的性質與其生物活性具有相關性，所以研究兩者的關系具有重要意義。

大豆皮是大豆加工中產生的副產物，約占籽粒的10%，含纖維性超過50%，是生產膳食纖維的良好資源。膳食纖維按溶解性可分為水溶性(SDF)和水不溶性(IDF)的膳食纖維，在性質和生理作用上有較大差異，其中SDF因更容易添加到食品中而被廣泛使用。本實驗研究了3種不同分子質量水溶性大豆皮的膳食纖維的單糖種類、結構及性質上的差異，以期為充分利用大豆皮開發膳食纖維提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究室自制3種不同分子質量水溶性大豆皮膳食纖維：SDF-1、SDF-2、SDF-3，其成分及分子質量分布見表1和表2。一級玉米油；溴化鉀、剛果紅、氫氧化鋇、硝酸銀、冰乙酸、鄰苯二甲醛、氫氧化鈉、鹽酸、水楊酸、無水乙醇、濃硫酸、過氧化氫、硫酸亞鐵等均為分析純。

表1 SDF-1、SDF-2、SDF-3的基本成分/%(干基)

表2 SDF-1、SDF-2、SDF-3的分子質量的分布情況

1.2 主要儀器與設備

210型高效液相色譜儀，NEXUS670傅里葉紅外光譜儀，銳影Empyrean高分辨率X-射線衍射儀，Q2000差示掃描量熱儀，NDJ-79旋轉黏度計。

1.3 方法

1.3.1 組成膳食纖維分子的單糖成分的測定[4]

采用高效液相色譜法測定。制樣：取樣0.1 g，加入5 mL 1 mol/L H2SO4，90 ℃水解2 h，冷卻后用Ba(OH)2中和至pH 6.0，靜置過夜，離心(4 000 r/min,10 min)，取上清水解液。測定條件：ShodexSP0810色譜柱，90 ℃柱溫，水流動相，流速0.6 mL/min，Optilab T-rEX示差檢測器，進樣量20 μL，運行時間30 min。

1.3.2 膳食纖維分子官能團的測定

將1 mg樣品與0.1 g 溴化鉀用瑪瑙研缽研磨成均勻粉末，手動壓力機壓制成薄片后，采用傅里葉紅外光譜在25 ℃，分辨率為4 cm-1，掃描次數為64次條件下進行全波段掃描(4 000～400 cm-1)。

1.3.3 剛果紅實驗[5]

取5 mg樣品，加入2.0 mL蒸餾水和2.0 mL 80 μmol/L的剛果紅試劑，加入1 mol/L的NaOH溶液，使反應體系中的NaOH濃度分別達到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L時，測其最大吸收波長。以不加樣本的剛果紅溶液為實驗對照。

1.3.4 膳食纖維分子的晶體結構的測定[6]

取0.1 g樣品放在載玻片上，用蓋玻片壓平，在Cu-Kα靶、0.02°步寬、6(°)/min掃描速率、5°～60°掃描范圍的條件下，進行X-射線衍射實驗。

1.3.5 膳食纖維熱穩定性的測定[7]

采用差示掃描量熱儀分析，取3 mg樣品于鋁盤中并壓片，以空鋁盤為對照。在氮氣流速50 mL/min，以10 ℃/min的升溫速率由20 ℃升至210 ℃。記錄此過程的起始溫度(T0)、峰值溫度(Tp)、終止溫度(Te)和熱焓變(ΔH)。

1.3.6 膳食纖維吸水(油)力的測定[8]

取樣品m0(小于3.0 g，水分為w)于質量為m1的離心管中，加入25 mL蒸餾水或食用油，室溫靜置1 h后，離心(2 500 r/min,10 min)，棄去上清液，并用濾紙吸干離心管壁殘留水分或食用油，稱重樣品和離心管(m2，g)。按式(1)計算吸水力(W)或吸油力(H)。

W或H=[(m2-m1)-m0(1-w))/ (m0(1-w)]

(1)

1.3.7 膳食纖維吸水膨脹力的測定[9]

取樣品m0(小于1.0 g，水分為w)置于量筒中，記錄樣品體積v0(mL)，在量筒中加入10 mL蒸餾水，充分振蕩，室溫下靜置24 h，記錄膨脹后體積v1(mL)。按式(2)計算膨脹力(S)。

S=(v1-vo)/[m0(1-w)]

(2)

1.3.8 膳食纖維膽固醇吸附能力的測定[9]

1.3.8.1 膽固醇標準曲線的制作

準確吸取0.25 mg/mL膽固醇標準溶液0、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 mL于比色管中，加入冰乙酸至0.80 mL，再依次加入1 mg/mL鄰苯二甲醛0.4 mL及混合酸(冰乙酸∶濃硫酸=1∶1)8 mL，靜置10 min，于550 nm處測定吸光值(y)。y與x(膽固醇的質量濃度，μg/mL)的關系曲線：y=0.000 4x-0.008 0，R2=0.997。

1.3.8.2 膽固醇吸附能力的測定

取鮮雞蛋蛋黃，加入9倍蒸餾水攪打成乳液。取4份蛋黃乳液(各30 mL)，其中2份加入樣品(m0=1.0 g，水分為w)，2份不加樣品，攪拌均勻。分別調節pH 2.0、7.0，37 ℃振蕩2 h后離心(4 000 r/min, 20 min)；各吸取0.1 mL上清液，按1.3.8.1步驟加入試劑，靜置后在550 nm處測吸光度，按標準曲線計算蛋黃中吸附前(m1)和吸附后(m2)的膽固醇量，按式(3)計算膽固醇吸附能力(D)。

D=(m1-m2)/[m0(1-w)]

(3)

1.3.9 膳食纖維與陽離子交換能力的測定[4]

取1.0 g(水分w)樣品，加入30 mL 0.1mol/L HCl，常溫靜置24 h后過濾，用蒸餾水洗至中性，加入10% AgNO3溶液不產生沉淀(即不含氯離子)為止。60 ℃烘至恒重后，取0.25 g，加入100 mL 15%的NaCl，攪拌均勻，緩慢滴加0.01 mol/L NaOH，并記錄NaOH加入量和pH的變化。

1.3.10 膳食纖維對羥自由基清除能力的測定[8]

分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g樣品，依次加入9 mmol/L水楊酸-乙醇0.5 mL、9 mmol/L FeSO40.5 mL、蒸餾水3.5 mL、88 mmol/L H2O25.0 mL，搖勻后離心(4 000 r/min ,20 min)，取上清液，在510 nm波長下測吸光度值OD1；0.5 mL蒸餾水代替9 mmol/L FeSO4溶液測得吸光度值為OD2；蒸餾水代替樣品為空白對照測OD3。按式(4)計算羥自由基清除率(R)。

R=[1-(OD1-OD2)/OD3]×100%

(4)

1.3.11 膳食纖維水溶液黏度的測定[8]

將質量濃度為10、20、50、100、150、200 mg/mL的樣品水溶液，分別采用0.5號轉筒，在750 r/min、剪切速率850 s-1的條件下測定黏度。

1.4 數據處理

每組實驗重復測定3 次，結果以x±s(平均值±標準差)表示，用Origin 9.0 繪制圖像，采用SPSS進行單因素方差分析進行差異顯著性比較，P<0.05 為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 水溶性大豆皮膳食纖維的單糖單元

纖維素(cellulose)是由D-葡萄糖單元通過β-1,4苷鍵連接組成、直鏈的大分子多糖。半纖維素是由多種單糖構成的、不均一，且大多帶有短支鏈的復合聚糖，其主鏈糖基有D-葡萄糖糖基、D-木糖糖基、D-半乳糖糖基、L-阿拉伯糖糖基和D-甘露糖糖基等。由表3可知，SDF-1、SDF-2、SDF-3分子的單糖單元中均含有葡萄糖、木糖、半乳糖和果糖，SDF-1還含有阿拉伯糖，說明它們源于半纖維素和纖維素。從含量上看，SDF-1和SDF-3的葡萄糖、木糖、半乳糖比較接近，SDF-3的果糖含量明顯高于SDF-1，達61.01%；SDF-2果糖含量最低，但葡萄糖含量最高，為41.09%，說明水溶性大豆皮膳食纖維雜多糖可能會存在果糖聚合的支鏈或片段。結果表明，3種分子質量水溶性大豆皮膳食纖維的單糖單元不同，含量也不同，會對其性質和功能產生影響。

表3 SDF-1、SDF-2、SDF-3的單糖單元及質量分數/%

2.2 水溶性大豆皮膳食纖維的分子官能團、三螺旋結構、結晶和熱穩定性

從圖1可見，3種分子質量水溶性大豆皮膳食纖維均存在有典型的糖類特征吸收峰。3 414 cm-1處的吸收峰說明含有羥基[10]；2 920 cm-1處的吸收峰說明甲基和亞甲基存在[11]；1 731 cm-1處的吸收峰說明含有醛基[12]；1 612 cm-1吸收峰說明存在羧酸根離子[13,14]；在1 415 cm-1出現吸收峰說明存在羰基[15]；1 071 cm-1處的吸收峰說明存在醚鍵[16]；在890 cm-1處的吸收峰，說明存在β-型糖苷鍵[17]。在840 cm-1處的吸收峰說明存在α-型糖苷鍵[18]。

表4數據表明，SDF-1、SDF-2和SDF-3與剛果紅試劑形成了絡合物，最大吸收波長發生明顯的升高并出現峰值，說明它們均具有三螺旋結構存在[19,20]，這是因為膳食纖維中纖維素的分子雖然沒有支鏈，但分子中鏈與鏈之間可借助分子間氫鍵像麻繩一樣擰緊的螺旋結構[21]，并可形成一定的結晶。峰值過后，SDF-1和SDF-2隨著NaOH濃度增大，最大吸收波長開始下降，這是因為過量的NaOH或在強堿環境下，破壞了與剛果紅試劑的絡合及三螺旋結構，部分結晶也會遭到破壞，向無規則線團鏈轉化[22]，甚至會使糖鏈降解。但SDF-3最大吸收波長基本沒有變化，說明膳食纖維分子質量的大小會影響其螺旋結構的緊密。分子質量大，則分子中鏈與鏈之間形成三螺旋結構和相互纏繞的機會更多，且更加緊密，不易被破壞。

圖1 SDF-1、SDF-2、SDF-3傅里葉紅外光譜圖

表4 SDF-1、SDF-2、SDF-3剛果紅實驗測定結果(最大吸收波長/nm)

由表5可見，SDF-2、SDF-3在17.36°存在一個弱衍射峰，即出現結晶區，而SDF-1沒有出現衍射峰，屬于無定形結構。說明分子質量大利于形成結晶，而SDF-1分子質量小，鏈短則鏈間利用氫鍵的形成的纏繞機會少且穩定性差，無法形成定型結構即結晶；SDF-2結晶區最大，可能與其葡萄糖單元含量最高，利于借助氫鍵形成鏈間穩定的螺旋纏繞[20]有關。同理，具有結晶和結晶區大的SDF-2的熱穩定性也最強，見表6，而分子質量最小、無結晶的SDF-1的熱穩定明顯不如SDF-2和SDF-3。

表5 SDF-1、SDF-2、SDF-3的X-衍射實驗結果

表6 大豆皮水溶性膳食纖維的DSC分析結果

2.3 水溶性大豆皮膳食纖維性質

由表7可知，隨著分子質量的增大，3種分子質量水溶性大豆皮膳食纖維的吸水力、吸水后的膨脹力、黏性增大，即SDF-1

當天然有機纖維與油料接觸時，油分子首先通過物理作用附著在纖維和半纖維表面，然后通過毛細管作用進入纖維間隙，最后油分子聚集在纖維內部間隙里[24]。因此，3種分子質量水溶性大豆皮膳食纖維均具有吸附油脂的作用。但隨著分子質量的增大，吸油量增大不明顯，可能是由于靜置時間僅1 h，物理吸附作用僅限于纖維表面，未能深入至纖維內部間隙中。

對于3種分子質量的水溶性大豆皮膳食纖維對陽離子的吸附作用比較來看，來源纖維素和半纖維素的SDF-1、SDF-2、SDF-3的分子中均含有較多羧酸根離子，明顯表現出弱酸性，酸性多糖類膳食纖維具有較強的離子交換能力[25]，即與陽離子螯合，呈現出一種能維持pH穩定的作用。從圖2可見，隨分子質量增大，弱酸性增強，因此，pH在堿性環境中上升也最慢，穩定作用最好。分子質量最小的SDF-1羧酸根離子相對少，但由于為無定形狀態，羧酸根離子暴露容易，與陽離子螯合的空間障礙也小，因此，更容易與陽離子螯合并達到飽和，從而對維持pH穩定的作用有限。SDF-2、SDF-3分子質量大，羧酸根離子相對多，但因分子鏈間纏繞并形成部分結晶，須在NaOH濃度不斷增大，使其纏繞和結晶被解析后，羧酸根離子逐步暴露，與陽離子螯合；另外，分子質量越大則空間障礙增大，也影響與與陽離子螯合，因此，隨分子質量增大，膳食纖維與陽離子螯合不斷隨羧酸根離子的暴露而進行，從而起到維持pH穩定的作用。

圖2 SDF-1、SDF-2、SDF-3的陽離子交換能力

由表7可見，3種分子質量水溶性大豆皮膳食纖維在pH2.0和7.0環境下，對膽固醇吸附能力均為SDF-1> SDF-3> SDF-2。膳食纖維對膽固醇吸附屬于多層吸附，羰基是吸附膽固醇的活性基團[26]，因此，纖維的孔密度和比表面積的大小，對吸附效果影響較大。分子質量小的SDF-1，比表面積最大，空間障礙最小，因此，吸附膽固醇的效果最好；SDF-3的吸附效果優于SDF-2，可能是同它們的單糖單元組成有關。由表2可知，葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖為醛糖，果糖為酮糖，SDF-2所含果糖含量最低，所具有的吸附膽固醇的活性羰基也最少，所以對膽固醇的吸附作用最小。

羥自由基由人體經過新陳代謝所產生，氧化能力很強，會引起組織細胞氧化損傷，從而導致機體膜過氧化和蛋白質交聯變性等，對人體健康傷害較大。由表7可見，3種分子質量水溶性大豆皮膳食纖維對羥自由基的清除能力為SDF-1> SDF-2> SDF-3。膳食纖維多糖的羥基能夠在氧化還原反應中提供電子或者氫原子[27]，可終止氧化鏈反應，因此，3種分子質量膳食纖維均具有清除羥自由基的能力。

表7 SDF-1、SDF-2、SDF-3的性質測定結果

膳食纖維通過羧基與金屬離子(陽離子)螯合[26]，抑制了金屬離子催化過氧化氫產生羥自由基的鏈反應，從而抑制了它在Fenton反應中的活性從而起到清除羥基自由基的作用[28]。從與陽離子交換能力來看，SDF-1能更易、更快地螯合金屬離子(陽離子)，另外，由X-射線衍射實驗結果可以得知，SDF-1無結晶形態，屬于無定形結構，羧基暴露多，空間障礙小，利于與羥自由基結合，所以大豆皮SDF表現出低分子質量組分清除能力顯著好于高中分子質量組分現象，這與Kitts等[29]的研究一致。SDF-2和SDF-3，雖然分子質量較大，所含羧基更多，但因分子間纏繞更多、羧基無法暴露，空間障礙也大，因此，清除羥自由基的清除能力反而不如小分子質量的膳食纖維多糖。

3 結論

本實驗中水溶性大豆皮膳食纖維具有典型糖類結構特征基團，其分子借助氫鍵作用均可形成鏈間的三螺旋結構，且隨分子質量增大，鏈間螺旋加纏繞更加緊密，可形成結晶部分，熱穩定性也隨之增強，分子質量最小的SDF-1，雖然分子間可以形成一定的三螺旋結構，但無法形成結晶。隨分子質量增大，水溶性大豆皮膳食纖維中的羥基、羧基等極性基團增多，吸水力、吸油力、吸水膨脹力、黏度增大，與陽離子交換和清除羥自由基的能力減小。SDF-1因呈無定型狀態，羧基等基團暴露充分、空間障礙小，與陽離子交換、清除羥自由基和吸附膽固醇的能力最強。