重復韌化對普通玉米淀粉消化、理化性質和結構特性的影響

王雨生, 尚夢珊, 陳海華,3

(青島農業大學食品科學與工程學院1，青島 266109) (青島農業大學學報編輯部2，青島 266109) (青島農業大學巴瑟斯未來農業科技學院3，青島 266109)

濕熱處理(HMT)是一種安全、高效的淀粉物理改性方法[1]，韌化處理(ANN)是濕熱處理方法之一，通常將樣品置于過量的水中，處理溫度介于淀粉的玻璃化轉變溫度和糊化溫度之間[2]。韌化處理能夠改變淀粉的物化性質而不引起淀粉糊化或者淀粉顆粒的破碎[3]。韌化處理時，淀粉顆粒形狀基本不變[4]，但顆粒表面會出現一些孔洞，這是內源性淀粉酶的作用及直鏈淀粉、支鏈淀粉重新結合的結果[3]。人們已經研究了韌化處理對木薯淀粉[5]、山藥淀粉[2]、大米淀粉[6]、高粱淀粉[7]、玉米淀粉[4, 8]和橡子淀粉[3]理化性質的影響，發現韌化處理一般不改變淀粉顆粒的結晶晶型，韌化處理后，淀粉主要發生的結構、性質變化為：淀粉顆粒的膨脹程度和峰值黏度降低[9]；糊化溫度升高，糊化溫度范圍減小[4]；吸水、吸油能力增強[10]；相對結晶度升高[11]；結晶結構完美程度和均一性增加[3]；淀粉顆粒內的淀粉分子鏈重排，相互作用增強[12]。王雨生等[13]研究還發現，延長韌化時間能夠進一步提高玉米淀粉的糊化溫度，提高韌化溫度可以進一步增強玉米淀粉結晶穩定性。這些研究主要是針對淀粉進行的單次韌化處理(SANN)。

目前越來越多的學者開始關注2次或者多次重復熱處理對淀粉理化性質和分子結構的影響。Chung等[10]發現，與單次韌化處理相比，韌化后再濕熱處理(ANN-HMT)、濕熱后再韌化處理(HMT-ANN)均能有效提高淀粉的熱穩定性，降低淀粉的回生值；Zeng等[6]發現，與普通大米淀粉相比，濕熱結合韌化處理(ANN-HMT或HMT-ANN)能降低糯性大米淀粉的糊化焓，提高其糊化溫度和抗性淀粉含量；Pinto等[14]指出，與單次韌化處理相比，HMT-ANN對淀粉糊化溫度和糊化焓的影響更明顯；Shang等[15]研究發現，與單次濕熱處理相比，2次濕熱處理對普通玉米淀粉理化性質的影響更顯著；Huang等[16]發現，增加重復濕熱處理的次數可以進一步改變甘薯淀粉的結構、理化及消化性質；Wang等[12]發現，韌化處理結合超高壓處理(ANN-UHP或UHP-ANN)能顯著改變山藥淀粉和馬鈴薯淀粉的糊化性質，嚴重破壞小麥淀粉的有序結構；Klein等[17]則報道，與單次濕熱處理相比，2次濕熱處理能降低大米淀粉膨脹力和溶解度，提高大米淀粉糊化黏度和糊化溫度。前人的這些研究主要集中于2次濕熱處理對不同來源淀粉的性質影響，目前很少有研究關注重復韌化處理對普通玉米淀粉理化性質和消化性質的影響。

本研究以普通玉米淀粉為研究對象，對比分析重復韌化處理次數對其微觀結構、結晶結構、糊化性質、凝膠硬度和消化率等性質的影響，研究結果對擴展改性淀粉的應用有一定實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通玉米淀粉(直鏈淀粉質量分數27%)，豬胰α-淀粉酶(VI-B，EC3.2.1.1, 16 U/mg)，糖化酶(EC3.2.1.3，100 U/mg)。

1.2 儀器與設備

TA·XT plus質構儀，S-3400N掃描電子顯微鏡，BK-POL偏光顯微鏡，D8-ADVANCE X射線衍射儀，iS10-type紅外光譜儀，4D-type快速黏度分析儀。

1.3 方法

1.3.1 重復韌化處理(RANN)

參照Chung等[18]的方法對普通玉米淀粉進行熱處理。取適量的普通玉米淀粉與水混合，調節含水量至80%。在55 ℃的水浴條件下振蕩處理24 h后，3 500 r/min離心15 min，真空抽濾以除去多余水分，所得沉淀在45 ℃烘箱中鼓風干燥至含水量為10%，研磨并過100目篩，得單次韌化處理樣品(RANN-1)。將單次韌化處理樣品再重復1次和2次，分別得2次韌化處理樣品(RANN-2)和3次韌化處理樣品(RANN-3)。

1.3.2 膨脹力測定

淀粉樣品膨脹力的測定參照Li等[19]的方法進行，膨脹力定義為樣品沉淀物的濕質量與淀粉樣品初始質量之比。

1.3.3 體外消化特性分析

參照Englyst等[20]和Wang等[21]的方法分析淀粉的體外消化特性。準確稱取淀粉樣品100 mg(以干基計)于具塞試管中，加入5 mL pH 5.2磷酸緩沖液，加入2.5 mL酶液(豬胰α-淀粉酶290 U/mL和糖化酶15 U/mL)，所得反應液于37 ℃振蕩水浴，分別在20 min和120 min時用移液槍取0.5 mL反應液至10 mL離心管中，加入4.5 mL體積分數為73%的乙醇溶液滅酶，混勻后3 500 r/min離心10 min，取1 mL上清液，采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS)測定樣品的快速消化淀粉(RDS)、緩慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)含量[22]。

1.3.4 糊化特性分析

參照Wang等[23]的方法，用RVA快速黏度計分析淀粉的糊化特性，記錄淀粉的糊化溫度(PT)、峰值黏度(PV)、崩解值(BD)和回生值(SB)等糊化特性參數。糊化后的樣品冷卻至室溫并置于4 ℃冰箱儲藏過夜，用于凝膠硬度的測定。

1.3.5 凝膠硬度分析

參照Wang等[24]方法，將1.3.4節所得淀粉凝膠取出后于室溫下放置30 min，用質構儀和P/0.5的圓柱形探頭分析樣品的凝膠硬度，測試速度為0.5 mm/s，觸發力為5 g，凝膠硬度為穿透深度10 mm時的最大力。

1.3.6 掃描電子顯微鏡觀察(SEM)

樣品粉末噴金后，固定在有導電性的雙面膠上，用掃描電子顯微鏡放大2 000倍觀察淀粉顆粒的微觀形貌。

1.3.7 偏光顯微鏡觀察

參照王雨生等[13]的方法，用偏光顯微鏡分析淀粉顆粒的偏光十字現象，取1%的淀粉懸濁液于偏光顯微鏡下，放大400倍觀察。

1.3.8 X射線衍射分析(XRD)

淀粉粉末放于X射線衍射儀玻璃樣品架凹槽內，攤平壓緊，采用單色Cu-Kα射線進行衍射掃描，掃描范圍4～40°，掃描速率0.1(°)/s，管電壓40 kV，管電流40 mA。參照Zhang等[25]方法計算淀粉的相對結晶度(RC)，即結晶區面積與總面積比值。

1.3.9 傅里葉紅外光譜分析(FT-IR)

參考Wang等[26]的方法分析，淀粉與溴化鉀按質量比1∶100混合均勻并壓片，FT-IR掃描范圍4 000～400 cm-1，每4 cm-1掃描64次。記錄FT-IR紅外圖譜，并計算1 047 cm-1和1 022 cm-1兩處吸收峰強度比(R1 047/1 022)。

1.3.10 數據統計與分析

所有實驗均重復3次，采用統計分析軟件SPSS17.0進行數據分析，采用ANOVA和Duncan’s多重比較法對所有數據進行方差分析和差異顯著性分析(P<0.05)，采用Excel 2016軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 重復韌化對淀粉膨脹力的影響

由表1可知，普通玉米淀粉的膨脹力為12.6 g/g，不同次數的韌化處理均顯著降低了普通玉米淀粉的膨脹力，且韌化次數越多，膨脹力越低。與普通玉米淀粉相比，韌化處理后淀粉的膨脹力降低了1.7～2.7 g/g，與RANN-1相比，RANN-3的膨脹力降低約1.0 g/g。這與Zeng等[6]、Chung等[27]、Huang等[16]2次濕熱處理豌豆淀粉、扁豆淀粉和蠟質大米淀粉時膨脹力的變化趨勢一致。膨脹力的降低可能是由于重復韌化處理增強了淀粉分子鏈間的相互作用力，使可利用羥基數量減少，限制了水分向淀粉顆粒內部的滲透[3]；另一個可能的原因是重復韌化處理增加了淀粉結晶結構的完美程度[2, 7]。

2.2 重復韌化對淀粉體外消化率的影響

如表1所示，韌化處理能夠改變普通玉米淀粉的消化率，重復不同次數的韌化處理均提高了RDS和SDS的含量，降低了RS的含量。2次韌化處理后，RDS和SDS比NCS的增加了2.2%和2.4%，而RS含量則降低了4.5%。這與Zeng等[6]、Chung等[10]報道的ANN-HMT處理對淀粉中RDS、SDS和RS含量的影響結果一致。RDS含量的增加、RS含量的降低可能是因為重復韌化處理使淀粉顆粒表面孔洞或裂縫增多，促進直鏈淀粉的滲漏，水解酶更容易進入淀粉顆粒內部[9]。SDS的增加則可能是由于韌化過程增強了淀粉分子鏈間的強相互作用，一定程度上限制了酶對淀粉分子鏈的作用[7]。淀粉的消化率通常受淀粉的來源、直支比和結晶結構的影響[7, 28，29]。Zeng等[6]研究表明單次韌化處理能夠改變淀粉的消化率，一方面，韌化處理導致直鏈淀粉與直/支鏈淀粉間相互作用的增強，趨向于形成具有完美晶體結構的淀粉，降低淀粉的消化率，另一方面，韌化處理使淀粉顆粒表面孔洞變多，則會提高淀粉的消化率。隨著韌化次數的增加，RDS和SDS的含量逐漸降低，RS的含量逐漸增加。這可能是因為多次韌化處理進一步增強了淀粉分子鏈間的強相互作用，進一步提高了結晶結構的完美程度。韌化溫度低于淀粉的糊化溫度，因此重復韌化處理過程中，淀粉顆粒不會發生糊化，但淀粉分子鏈會發生重排導致淀粉顆粒結構改變，如導致結晶度增加等[7]。盡管淀粉顆粒表面的孔洞、裂縫增多，但淀粉顆粒結構的改變使進入淀粉顆粒內部的水解酶不能進行有效水解[7, 27]，即淀粉分子鏈的相互作用、結晶完美程度對淀粉消化率起到更加重要的抑制影響，這與Zeng等[6]的觀點一致。因此，增加重復韌化次數是改變淀粉RDS、SDS和RS含量的一種重要方式。

表1 不同次數韌化處理的普通玉米淀粉膨脹力和體外消化參數

2.3 重復韌化對淀粉凝膠硬度的影響

普通玉米淀粉凝膠硬度為266 g(圖1)，經不同次數的韌化處理后，凝膠硬度顯著增加了115～192 g，且隨著韌化處理次數的增加，凝膠硬度從RANN-1的381 g逐漸增加至RANN-3的458 g。Shang等[15]發現，經過2次濕熱處理，淀粉凝膠硬度增加。凝膠硬度的增加可能是因為熱處理使淀粉鏈之間的相互作用增加，淀粉凝膠中形成了較強的連接區[15]；另外，重復韌化處理進一步提高淀粉顆粒結晶結構的完美程度[30]，也會增加淀粉凝膠硬度。凝膠的形成可能與直鏈淀粉線性鏈段的平行排列有關[8]，其硬度主要由淀粉結晶區膨脹顆粒的硬度決定[29]。韌化處理樣品中，RANN-3的凝膠硬度最高，這也說明淀粉凝膠硬度與韌化處理次數有關。

注：柱狀圖上的不同小寫字母表示數據間存在顯著差異(P<0.05)。圖1 RANN處理的普通玉米淀粉凝膠的硬度

2.4 掃描電鏡和偏光顯微鏡圖片

根據掃描電鏡觀察結果(圖2a～圖2d)，普通玉米淀粉由體積大而不規則的多角形顆粒和一些體積較小的球形顆粒組成，表面光滑，這與Liu等[7]的報道一致。重復韌化處理并沒有改變普通玉米淀粉的顆粒狀態，沒有出現淀粉顆粒聚集狀態，這與已有研究，即單次韌化處理不顯著影響蠟質玉米淀粉、高直鏈玉米淀粉[4]、橡子淀粉[3]的形狀等結果一致；Molavi等[3]也報道，橡子淀粉在ANN-HMT處理中沒有出現淀粉聚集狀態。這可能是因為韌化處理溫度為55 ℃，低于普通玉米淀粉的糊化溫度[1]，可以保護淀粉顆粒結構的完整性。

但重復韌化處理對普通玉米淀粉顆粒外貌有影響，與天然淀粉顆粒相比，重復韌化處理后，淀粉顆粒表面出現很多孔洞，且隨著韌化處理次數的增加，越來越多的淀粉顆粒形成多孔表面。對比可以發現，RANN-1的淀粉顆粒表面孔洞少、小、淺，而RANN-2和RANN-3淀粉顆粒表面孔洞多、大、深。這說明韌化次數越多，對淀粉顆粒形貌的影響則越大。Huang等[16]發現，多次HMT處理能使甘薯淀粉顆粒形成多孔表面，Molavi等[3]也發現，ANN-HMT可以在橡子淀粉表面形成很多孔洞。淀粉顆粒表面孔洞的產生可能是因為重復韌化處理促進了小分子直鏈淀粉從淀粉顆粒中游離出來，從而留下較多的孔洞[3]；也可能是在內源酶的作用下，重復韌化處理加速了酶對淀粉顆粒表面的侵蝕[31，32]。

注：a，e NCS; b，f RANN-1;c，g RANN-2;d，h RANN-3。圖2 重復韌化處理普通玉米淀粉的掃描電鏡圖(×2 000，a～d)和偏光顯微鏡圖(×400，e～h)

在偏振光下，普通玉米淀粉呈現典型的偏光十字現象(圖2e～圖2h)，而重復韌化處理并沒有改變淀粉顆粒的雙折射特性，這與Chung等[27]、Vamadevan等[4]報道的單次韌化處理不改變豌豆淀粉、扁豆淀粉、蠶豆淀粉雙折射特性的結果一致。這表明，重復韌化處理過程中，淀粉的顆粒結構和層狀結構未被破壞，能產生雙折射現象的結晶結構保存完好。

2.5 重復韌化普通玉米淀粉的X射線衍射圖譜和相對結晶度

普通玉米淀粉在2θ為15.3°、17°、18°和23.5°附近有明顯的衍射峰(圖3)，為典型的A型結晶結構。19.8°處的衍射峰說明普通玉米淀粉顆粒具有V型結晶結構，這可能是由于普通玉米淀粉具有直鏈淀粉-脂肪酸復合物的有序結構[4]。與普通玉米淀粉相比，重復韌化處理均沒有改變淀粉顆粒的結晶晶型。Wang等[12]發現，在ANN-UHP處理過程中，小麥淀粉、山藥淀粉和馬鈴薯淀粉的X射線衍射圖譜沒有明顯變化，Shang等[15]的研究結果也說明兩次濕熱處理沒有改變普通玉米淀粉的結晶晶型。上述結果表明，重復韌化處理過程中淀粉的雙螺旋結構并沒有發生熔融，結晶晶型未被破壞。

普通玉米淀粉的相對結晶度RC為32.3%，重復韌化處理后，RC明顯增加。與普通玉米淀粉相比，RANN-3的RC增加了4.1%。隨著韌化處理次數的增加，RC逐漸升高，這可能是因為韌化處理[6]增加了淀粉結晶結構的完美程度，晶粒的取向性增強，原本未相互交聯的淀粉分子在韌化條件下發生相互作用而形成新的結晶[6, 28]。這一結果表明韌化處理次數影響淀粉的RC。

圖3 普通玉米淀粉重復韌化處理前后的XRD圖譜

2.6 重復韌化普通玉米淀粉的紅外光譜

圖4為普通玉米淀粉FT-IR圖譜淀粉骨架吸收峰信息：位于3 443 cm-1和2 928 cm-1附近的寬峰是—OH和—CH的拉伸振動[33]；位于1 644 cm-1和1 155 cm-1附近的吸收峰是H2O彎曲振動和C—O—C拉伸振動[34]；位于1 080 cm-1、1 023 cm-1和930 cm-1附近的吸收峰是C—O—H彎曲振動和—CH2的拉伸振動[16]。不同次數的韌化處理對普通玉米淀粉典型吸收峰沒有明顯的影響，這一結果與Zeng等[6]研究單次韌化處理對蠟質玉米淀粉的影響結果一致。

圖4 普通玉米淀粉重復韌化處理前后的FT-IR圖譜

位于1 047 cm-1和1 022 cm-1處的吸收峰反映淀粉中的有序結構和無定型結構，通常用兩處的吸收峰強度比表示(R1 047/1 022)[16]。根據圖4，隨著韌化處理次數的增加，R1 047/1 022逐漸增加，比普通玉米淀粉增加了0.11～0.15。Zeng等[6]發現ANN-HMT提高了蠟質大米淀粉的R1 047/1 022，Huang等[16]報道重復HMT處理次數超過3次，甘薯淀粉的R1 047/1 022明顯增加，Chung等[27]發現濕熱處理不改變淀粉的FT-IR圖譜，但對淀粉的R1 047/1 022產生明顯的影響。這表明，重復韌化處理提供的熱能和高濕度能促使淀粉結晶區形成更多的雙螺旋結構[6]，促進淀粉顆粒表面形成更加完美的結晶結構。這與相對結晶度的結果一致。

2.7 重復韌化普通玉米淀粉的糊化性質

由表2可以看出，重復韌化處理對普通玉米淀粉的糊化特性有顯著影響：糊化溫度(PT)明顯升高，峰值黏度(PV)、崩解值(BD)、回生值(SB)顯著降低。PT是淀粉顆粒開始吸水膨脹并形成黏稠溶液的溫度有關[15]。隨著韌化處理次數的增加，與天然淀粉相比，PT增加了1.7～2.3 ℃，但是RANN-2和RANN-3之間的變化很小。糊化溫度的提高說明RANN提高了淀粉結晶結構的完美程度，即破壞淀粉顆粒結構并形成淀粉糊所需的能量增加，因此糊化溫度升高[35]，這與X射線衍射實驗、紅外光譜實驗結果一致。其原因可能是重復韌化處理促進淀粉分子重排，提高了淀粉顆粒內部分子間的相互作用力[2]。

隨著韌化處理次數的增加，與普通玉米淀粉相比，峰值黏度降低了217～361 mPa·s，但RANN-2和RANN-3的峰值黏度沒有顯著差別。這與之前報到的ANN-HMT處理能降低橡子淀粉PV的結果一致[3]。加熱過程中，淀粉糊黏度的增加主要是由于淀粉顆粒的膨脹、滲漏直鏈淀粉相互作用、支鏈淀粉含量增加等[18]。PV降低可能是由于重復韌化處理使淀粉顆粒內部分子鏈重排，降低了淀粉顆粒的膨脹程度，束縛了直/支鏈淀粉的滲漏和溶解，從而使淀粉糊黏度下降[35]。另外，韌化處理有利于淀粉分子鏈形成穩定的構象，可能會進一步限制直鏈淀粉分子從淀粉顆粒中滲漏出來[5]。

表2 RANN處理前后普通玉米淀粉的糊化參數

與普通玉米淀粉相比，重復韌化處理后，淀粉的BD和SB明顯降低，且隨著重復韌化處理次數的增加，BD和SB均逐漸降低。這一結果與ANN-HMT處理能夠降低玉米淀粉[18]和橡子淀粉[3]的BD、SB結果一致。韌化處理后，淀粉BD的降低說明重復韌化處理提高了淀粉糊對熱和剪切的穩定性[14, 16]。這可能是因為重復韌化處理使淀粉分子鏈重新取向、排列，強化了直鏈淀粉與支鏈淀粉側鏈間的相互作用[2, 14]，增加了淀粉糊化過程中淀粉顆粒的破碎難度。冷卻過程中，滲漏直鏈淀粉分子可通過氫鍵重新排列，形成聚集體[29]，表現為淀粉糊液黏度升高，但重復韌化降低了普通玉米淀粉的SB，可能是由于重復韌化處理形成一些結構致密的顆粒，導致滲漏直鏈淀粉分子鏈的相互交聯作用不充分[18, 35]。

因此，普通玉米淀粉經重復韌化處理后，PT值升高，即破壞淀粉的顆粒結構需要更高的溫度；BD和SB值降低，淀粉顆粒的熱穩定性升高，淀粉的老化減緩；增加重復韌化處理的次數，可進一步促進淀粉分子鏈間的重新締合，提高淀粉糊的穩定性。

3 結論

研究重復韌化處理對普通玉米淀粉消化特性、理化特性和結構特性的影響。結果表明，重復韌化處理能夠降低普通玉米淀粉抗性淀粉含量，減小淀粉膨脹力、糊化峰值黏度、衰減值和回生值，提高普通玉米淀粉緩慢消化淀粉含量，提高淀粉的糊化溫度、相對結晶度及R1 047/1 022值。重復韌化處理在淀粉顆粒表面產生很多孔或洞，但并不改變淀粉顆粒的微觀形貌、結晶晶型和結構。增加韌化處理次數，可以進一步提高普通玉米淀粉抗性淀粉含量、相對結晶度和糊化溫度，降低衰減值和回生值等。重復韌化處理通過促進淀粉分子鏈的重新排列而達到優化普通玉米淀粉結構和性質的作用。