蕎麥抗性糊精制備工藝的條件優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)表征

蘇有韜, 王維浩,2, 魏春紅, 武云嬌, 王一飛, 趙姝婷, 劉德志, 曹龍奎,2

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319) (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心2，大慶 163319)

膳食纖維具有調(diào)節(jié)血糖[1，2]，血脂和腸道菌群的作用[3]。根據(jù)其溶解性，又可分為水溶性膳食纖維(SDF)和水不溶性膳食纖維(IDF)[4]，抗性糊精是一種小分子SDF，又稱作難消化糊精，是一種以淀粉為原料深加工的產(chǎn)物，具有耐消化和良好的加工特性，如熱穩(wěn)定，易溶于水和低黏度等特點(diǎn)，在面包中應(yīng)用可以改善面包的口感和色澤[5]；在飲料加工中可以代替高能量飲料中部分脂肪和糖類，開發(fā)出低GI飲料[6]；添加到乳制品中可以強(qiáng)化乳品中所缺少的膳食纖維，并不會(huì)影響乳品本身的質(zhì)構(gòu)；因抗性糊精具有抑制血糖和胰島素的上升，所以在保健品等領(lǐng)域也有涉及[7-9]。

蕎麥?zhǔn)且环N重要的功能性食品，其主要組成成分為淀粉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%～70%[10]。蕎麥淀粉在工業(yè)上被廣泛應(yīng)用，但在食品工業(yè)上研究較少[11]，將蕎麥淀粉加工成抗性糊精，應(yīng)用到食品加工工業(yè)上[12]，將具有非常大的潛力，同時(shí)也拓展了蕎麥淀粉在食品領(lǐng)域的應(yīng)用前景。因此，本研究將以蕎麥淀粉為原料，利用酸熱法制備蕎麥抗性糊精，探究糊精化前后二者在結(jié)構(gòu)上的差異，并為蕎麥抗性糊精在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

蕎麥米、耐高溫α-淀粉酶(4×104U/g)、淀粉葡萄糖苷酶(1×105U/mL)；溴化鉀:光譜級；鹽酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、水楊酸、無水乙醇：分析純。

SU8020場發(fā)射電子掃描電子顯微鏡，D8 ADVANCE X射線衍射儀，NP-800PRF偏光顯微鏡，Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀，WSC-S測色色差儀，DGG-9053A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，DK-S24型恒溫水浴鍋，TGL16B型臺式離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 蕎麥淀粉的提取

蕎麥淀粉的提取參照周小理等[10]的方法，稱取新鮮蕎麥500 g，進(jìn)行除雜清洗，多次水洗后，按照水與蕎麥質(zhì)量比1∶2.5進(jìn)行浸泡，再加入4 g的無水硫酸鈉固體粉末，用鹽酸(1 mol/L)調(diào)節(jié)pH到2，于35 ℃下浸泡24 h后，換水磨漿4次，并多次過濾，直到充分洗出淀粉，再將濾液離心(5 000r/min，10 min)得到粗淀粉，將粗淀粉經(jīng)鹽酸(0.01 mol/L)漂洗，蕎麥粗淀粉與洗液質(zhì)量比為1∶10，漂洗3次后離心(5 000 r/min，10 min)；再經(jīng)NaOH(0.000 1 mol/L)漂洗，蕎麥粗淀粉與洗液質(zhì)量比為1∶15，漂洗3次，離心，沉淀溶解于蒸餾水，調(diào)溶液pH到7，離心(5 000 r/min，10 min)后除去上層及底部殘?jiān)胖煤嫦?5 ℃干燥48 h，得蕎麥淀粉，得率為(58.9±2.71)%。

1.2.2 蕎麥抗性糊精的制備工藝

蕎麥抗性糊精的制備參考文獻(xiàn)[13]的方法，并加以修改，具體操作為：稱取一定量的蕎麥淀粉，用0.1 mol/L鹽酸進(jìn)行噴灑加入淀粉中，進(jìn)行攪拌混勻，保證淀粉與鹽酸充分接觸，獲得以干淀粉為基礎(chǔ)的0.15%的最終鹽酸濃度，再放入烘箱(溫度55 ℃)干燥到水分<5%，再放入烘箱高溫?zé)峤猓瑹峤鉁囟?60 ℃，熱解時(shí)間100 min，即可得到粗品糊精，加3倍淀粉質(zhì)量的蒸餾水溶解，在用濃度為0.1%鹽酸溶液和0.1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.5，加入1%的耐高溫α-淀粉酶，并水浴加熱(95 ℃、2 h)，滅酶(100 ℃，10 min)，再調(diào)節(jié)pH至4.5，加入0.1%的淀粉葡萄糖苷酶水浴加熱(55 ℃、4 h)，滅酶(100 ℃，10 min)；放入離心機(jī)進(jìn)行離心(4 000 r/min、10 min)，在加入3倍液體體積的95%的乙醇，邊加入邊攪拌至沉淀產(chǎn)生，靜置4 h后，倒掉上清液，沉淀55 ℃烘干至恒重，得到蕎麥抗性糊精，計(jì)算公式為：

式中：m為蕎麥抗性糊精得率/%；m1為蕎麥抗性糊精質(zhì)量/g；m2為蕎麥淀粉質(zhì)量/g。

1.2.3 蕎麥抗性糊精DE值測定[14]

采用3.5-二硝基水楊酸比色法進(jìn)行糊精DE值測定。

1.2.3.1 制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用3.5-二硝基水楊酸比色法測定葡萄糖含量，準(zhǔn)確稱取已烘至恒重的葡萄糖100 mg，溶解定容至100 mL容量瓶中，移取0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、0.11 mL上述標(biāo)液于25 mL具塞刻度試管中，加入蒸餾水補(bǔ)至2 mL，分別加入2 mL 3.5-二硝基水楊酸試劑后于沸水浴中加熱5 min，流水迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，用分光光度計(jì)在波長為520 nm 處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=6.533 6x+0.036，R2=0.997 0，y為標(biāo)準(zhǔn)溶液在520 nm處吸光度，x為葡萄糖含量/(mg)。

1.2.3.2 樣品測定

樣品適當(dāng)稀釋后，使其質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，取稀釋液2 mL，加入2 mL 3.5-二硝基水楊酸試劑后于沸水浴中加熱6 min，流水迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，用分光光度計(jì)在520 nm波長處測定吸光度，計(jì)算出樣品中還原糖含量。

1.2.3.3 葡萄糖當(dāng)量(DE)值的測定

式中：DE為葡萄糖當(dāng)量值/%；C1為還原糖含量/g/mL；C2為總固形物含量/g/mL。

1.2.4 蕎麥抗性糊精的色度[15]

采用WSC-S測色色差儀測定。結(jié)果用L*、a*、b*3個(gè)參數(shù)表示；其中L*表示亮(白)度,a*表示紅色至綠色, b*表示黃色至藍(lán)色。

1.2.5 蕎麥抗性糊精單因素實(shí)驗(yàn)方法1.2.5.1 鹽酸添加量對得率的影響

稱取10.00 g蕎麥淀粉，噴灑鹽酸，獲得以干淀粉為基礎(chǔ)的0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%的最終鹽酸濃度，酸熱溫度160 ℃，酸熱時(shí)間100 min，酶解，離心取上清液，醇沉，干燥稱重，得到蕎麥抗性糊精，計(jì)算得率。

1.2.5.2 酸熱溫度對得率的影響

稱取10.00 g蕎麥淀粉，噴灑鹽酸，獲得以干淀粉為基礎(chǔ)的0.15%的最終鹽酸濃度，酸熱溫度120、140、160、180、200 ℃酸熱時(shí)間100 min，酶解，離心取上清液，醇沉，干燥稱重，得到蕎麥抗性糊精，計(jì)算得率。

1.2.5.3 酸熱時(shí)間對得率的影響

稱取10.00 g蕎麥淀粉，噴灑鹽酸，獲得以干淀粉為基礎(chǔ)的0.15%的最終鹽酸濃度，酸熱溫度160 ℃，酸熱時(shí)間60、80、100、120、140 min，酶解，離心取上清液，醇沉，干燥稱重，得到蕎麥抗性糊精，計(jì)算得率。

1.2.6 蕎麥抗性糊精正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以鹽酸添加量、酸熱溫度和酸熱時(shí)間為單因素，蕎麥抗性糊精得率和DE值為指標(biāo)，采用L9(34)進(jìn)行優(yōu)化最佳制備工藝。設(shè)計(jì)制備工藝水平表，見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.7 蕎麥淀粉與蕎麥抗性糊精的微觀結(jié)構(gòu)1.2.7.1 偏光十字測定方法[16]

稱取一定質(zhì)量蕎麥淀粉于離心管中，配置1%的淀粉溶液，抗性糊精則用95%乙醇配置，取0.1 mL溶液于載玻片上，蓋上載玻片，將氣泡趕走，在合適的放大倍數(shù)下在偏光顯微鏡下觀察淀粉和抗性糊精。

1.2.7.2 掃面電鏡測定方法[17]

取適量樣品，將其分散于貼有雙面膠的樣品臺上，通過離子濺射噴金使樣品導(dǎo)電后，之后置于掃描電子顯微鏡，20 kV加速電壓下分別調(diào)整放大倍數(shù)，觀察5.00 μm和50.00 μm下蕎麥淀粉和蕎麥抗性糊精的表面結(jié)構(gòu)。

1.2.8 紅外光譜測定方法

利用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行測定，將蕎麥淀粉和蕎麥抗性糊精分別與KBr混合研磨，利用真空壓片機(jī)進(jìn)行壓片，在4 000～400 cm-1范圍進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.2.9 X-射線衍射測定方法[18]

將蕎麥淀粉及蕎麥抗性糊精進(jìn)行干燥、粉碎，采用X-射線衍射儀測定。

1.2.10 分子質(zhì)量測定方法[19]

參照王娟等方法，稱取適量樣品于容量瓶中，用流動(dòng)相溶解，定容。色譜條件：色譜柱：TSKgel GMPWXL,流動(dòng)相：水相，少量硝酸鈉、疊氮化鈉，流速：0.5 mL/min, 柱溫：30 ℃,進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行，取其平均值，采用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并分析，采用 ANOVA 對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)；采用origin 9.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

從圖1可以看出，隨著鹽酸添加量的增加，蕎麥抗性糊精的得率也隨之增加，在鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%左右得率趨于平穩(wěn)，相關(guān)研究表明，鹽酸添加量增多，會(huì)使蕎麥淀粉降解出小分子物質(zhì)，加劇了小分子物質(zhì)在高溫條件下重新聚合，能被α-淀粉酶和糖化酶酶解的糖苷鍵被破壞，形成了不被酶解的糖苷鍵，例如α-1,2、α-1,3、β-1,2和β-1,6 糖苷鍵，但隨著鹽酸添加量增加，發(fā)生了熱降解，單糖從抗性糊精上脫落，生成大量小分子單糖，單糖含量變多，經(jīng)過酶解，生成大量還原糖，DE值反映了抗性糊精經(jīng)過醇沉，其中還有經(jīng)過酶解殘留的還原糖，因此DE值增高；同時(shí)抗性糊精顏色會(huì)發(fā)生變化，由白色逐漸變成黃色，并伴隨有焦糊氣味產(chǎn)生，會(huì)不利于抗性糊精后期的脫色處理，所以在鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%最好[20]。

制備蕎麥抗性糊精，固定鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%，酸熱時(shí)間為100 min。從圖1可以看出，蕎麥抗性糊精的得率與酸熱溫度升高呈線性關(guān)系，溫度越高，得率越增加，在升高至160 ℃之后得率緩慢增加，達(dá)到200 ℃含量有所下降，DE值隨著溫度升高而降低，到160 ℃開始升高，這是因?yàn)槭w麥淀粉經(jīng)過酸解和高溫，生成不被α-淀粉酶和糖化酶酶解的新結(jié)構(gòu)，抗性含量增加，得率增加，DE值降低，在更苛刻的條件下，會(huì)有更大程度的轉(zhuǎn)葡萄糖和再聚合的可能發(fā)生，導(dǎo)致抗性糊精與分子質(zhì)量略有增加，但也會(huì)含有較短的支鏈產(chǎn)生[21]，同時(shí)生成小分子物質(zhì)，在較低溫度下，不利于其再聚合，單糖含量增大，抗性糊精得率下降很多，在經(jīng)過酶解，生成大量還原糖，DE值含量增大表示抗性糊精中有部分還原糖，在高溫條件下，熱分解導(dǎo)致得率下降，大量小分子單糖脫落，也會(huì)導(dǎo)致DE值增大，同時(shí)糊精顏色逐漸由白色變成黃褐色，水溶性增加，并伴隨產(chǎn)生焦糊味，不利于對后期的處理，最佳酸熱溫度為160 ℃。

制備蕎麥抗性糊精，固定鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%，酸熱溫度160 ℃。從圖1可以看出，隨著酸熱時(shí)間的增加，抗性糊精的得率也隨之增加，在時(shí)間100 min時(shí)，得率趨于平穩(wěn)，達(dá)到51%不再增加，同時(shí)抗性糊精顏色隨時(shí)間的增大而逐漸由白色變成黃褐色，總體來看，酸熱時(shí)間對抗性糊精的得率影響趨勢不大，DE值在時(shí)間120 min時(shí)達(dá)到最低，達(dá)到20.2%，繼續(xù)增加酸熱時(shí)間不利于抗性糊精的形成，經(jīng)過酶解，反而會(huì)使殘留的抗性糊精中還原糖增加，導(dǎo)致了DE值增大，為后期進(jìn)一步純化處理很麻煩，不利于在食品工業(yè)上計(jì)算成本和效率問題，因此，最佳酸熱時(shí)間為120 min。

圖1 不同條件對抗性糊精得率和DE值的影響

2.2 蕎麥抗性糊精正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分析

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3、表4，通過R值的大小可知，影響得率的因素排序?yàn)辂}酸添加量>酸熱溫度>酸熱時(shí)間，影響DE值的因素排序?yàn)辂}酸添加量>酸熱溫度>酸熱時(shí)間，通過表3和表4可知鹽酸添加量和酸熱溫度對得率影響極顯著(P<0.01)，酸熱時(shí)間顯著(P<0.05)，鹽酸添加量和酸熱溫度對DE值影響顯著(P<0.05)，酸熱時(shí)間不顯著；影響得率的最優(yōu)組合為A2B2C2，影響DE值的最優(yōu)組合為A2B2C1，根據(jù)能耗和成本計(jì)算綜合考慮，確定蕎麥抗性糊精制備工藝最優(yōu)組合為A2B2C1，即鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%，酸熱溫度180 ℃，酸熱時(shí)間100 min。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 蕎麥抗性糊精制備工藝優(yōu)化得率方差分析表

表4 蕎麥抗性糊精制備工藝優(yōu)化DE值方差分析表

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳工藝條件為鹽酸添加量為0.2%；酸熱溫度180 ℃；酸熱時(shí)間100 min；結(jié)果表明，蕎麥抗性糊精得率為(56.8±0.45)%，DE值為(19.9±0.71)%，高于單因素最佳得率和低于單因素最佳DE值，證明該工藝可行性。

2.4 淀粉與抗性糊精色度分析

如表5所示，蕎麥淀粉制備蕎麥抗性糊精其顏色變化明顯，這是由于在高溫條件下，淀粉發(fā)生焦糊化反應(yīng)，顏色由白色變?yōu)辄S色，L*由93.62降低到45.95，代表顏色更偏離白色；a*由0.43升高到7.05，代表顏色更偏向紅色；b*由4.11升高到7.03，代表顏色更偏向黃色。

表5 蕎麥淀粉與蕎麥抗性糊精色度

2.5 微觀結(jié)構(gòu)測定結(jié)果與分析

2.5.1 偏光十字測定結(jié)果與分析

由圖2a可知，蕎麥淀粉的雙折射現(xiàn)象呈現(xiàn)出偏光十字，這是淀粉球晶結(jié)構(gòu)所具有的，這種變化在一定程度上反映了蕎麥淀粉支鏈的螺旋形成結(jié)晶的徑向取向和蕎麥淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)[22，23]。由圖2b可知，淀粉特有的結(jié)晶結(jié)構(gòu)已破環(huán)，無法觀察到偏光十字，呈碎片狀，由于淀粉通過酸熱處理，使淀粉的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖2 蕎麥淀粉與蕎麥抗性糊精偏光十字圖(×400)

2.5.2 掃描電鏡測定結(jié)果與分析

由圖3可以觀察出由蕎麥淀粉變成蕎麥抗性糊精，結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變，證實(shí)了嚴(yán)酷的條件可以有效地摧毀了淀粉顆粒內(nèi)部有秩序的結(jié)構(gòu)[21]。左側(cè)蕎麥淀粉形狀多是球形和不規(guī)則的多面體形，顆粒較小，而右側(cè)蕎麥抗性糊精則失去淀粉原有的結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出小碎片和小碎片聚合的塊狀，這是因?yàn)榈矸鄯肿釉谒釤徇^程中，失去了原有的分子結(jié)構(gòu)，形成了很多鏈狀結(jié)構(gòu)和單糖，又重新進(jìn)行無規(guī)律的聚合，進(jìn)行酶解純化后，形成大小不一，無規(guī)則，多孔狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致水分子有利于滲透，使水溶性增加。

圖3 蕎麥淀粉與蕎麥抗性糊精的掃描電子顯微鏡圖

2.5.3 紅外光譜測定結(jié)果與分析

圖4 蕎麥抗性糊精(A)與蕎麥淀粉(B)的紅外光譜圖

2.5.4 X-衍射測定結(jié)果與分析

從圖5觀察蕎麥淀粉和蕎麥抗性糊精的XRD衍射結(jié)果，蕎麥淀粉的晶型是A型，在2θ為15.35°、17.12°、18.03°、23.43°出現(xiàn)衍射峰，與現(xiàn)有研究一致[24]；由淀粉制備抗性糊精，晶型發(fā)生了很大的改變，原有的衍射峰消失，在20°左右出現(xiàn)衍射峰，晶型屬于非晶型，可以得知，經(jīng)過酸解和高溫的處理，淀粉的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變，與抗性糊精明顯不同，通過掃描電鏡觀察結(jié)果一致。

圖5 蕎麥淀粉(A)與蕎麥抗性糊精(B)的X射線衍射譜圖

2.6 抗性糊精的分子質(zhì)量

通過表6可以得知蕎麥抗性糊精平均分子質(zhì)量為3 895 u，相對于淀粉這種多糖聚合物，是一種小分子的物質(zhì)，結(jié)合圖2，更進(jìn)一步說明了結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，經(jīng)過破壞聚合，生成了糖類物質(zhì)，可以推斷，淀粉經(jīng)過酸和高溫處理，在經(jīng)過酶解，結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，鏈狀結(jié)構(gòu)被破環(huán)，生成了大量小分子的多糖結(jié)構(gòu)。

表6 蕎麥抗性糊精分子質(zhì)量測試結(jié)果

3 結(jié)論

以蕎麥淀粉為原料，采用了酸熱法制備抗性糊精，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交優(yōu)化，確定了最佳工藝條件為鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%；酸熱溫度180 ℃；酸熱時(shí)間100 min；制備蕎麥抗性糊精的得率為56.8%，DE值為19.9%，通過酸熱處理，抗性糊精由白色變成黃色，水溶性增加，結(jié)構(gòu)有了明顯的改變，表面粗糙疏松多孔，呈無規(guī)則形狀，平均分子質(zhì)量為389 5 u，屬于小分子量的水溶性膳食纖維。