高氏盆炎方三號對慢性盆腔炎大鼠炎癥介質和生殖功能的影響

郝艷紅 高 慧 劉玉蘭

(承德醫學院附屬醫院，承德，067000)

盆腔炎性疾病(Pelvic Inflammatory Disease，PID)是指女性上生殖道的一組感染性疾病，包括子宮內膜炎，子宮體炎，輸卵管炎，卵巢炎和盆腔腹膜炎等[1]。PID是我國常見的一種婦科疾患，是不孕癥的常見病因之一。當患者急性盆腔炎癥未徹底治愈或勞累體虛或因病原體對藥物不敏感以致病情遷延可導致盆腔炎性疾病后遺癥(Sequelae of Pelvic Inflammatory Disease,SPID)即慢性盆腔炎(Chronic Pelvic Inflammatory Disease，CPID)，而長期慢性炎癥存在或盆腔炎性疾病反復發作累及輸卵管，導致輸卵管性不孕。有研究報道，PID致輸卵管阻塞引起的不孕占20%～40%，且不孕癥的發生與患者PID的發作次數有明顯相關性，發作次數增加，不孕發生率隨之上升；病程越長，不孕發生率越高，嚴重影響育齡期女性的生殖健康[2-3]。中醫無“盆腔炎”之病名，可歸屬于“不孕”“帶下病”“婦人腹痛”“癥瘕”等疾病范疇。臨床上高氏盆炎方三號治療CPID及炎性不孕取得了較好的效果，本研究通過苯酚凝膠聯合機械損傷制備大鼠CPID模型，觀察高氏盆炎方三號對CPID大鼠子宮組織病理及炎癥介質的影響，并進一步觀察其對盆腔炎大鼠生殖功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雌性SD大鼠70只，體質量220～250 g，無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)清潔級，大鼠及飼料由河北醫科大學動物實驗室提供，動物飼養于自然光照條件好，室溫在21～23 ℃的環境中。許可證號：SCXK(冀)2013-1003，批號：1801215。本研究獲承德醫學院附屬醫院醫學倫理委員會批準，嚴格遵守實驗動物福利和倫理原則。

1.1.2 藥物 人胎盤組織液2 mL/支×6支/盒(湖南一格制藥有限公司，生產批號：201705014)；蒲苓盆炎康顆粒(翔宇藥業股份有限公司，生產批號：170724)。高氏盆炎方三號中藥組成：皂角刺30 g、當歸12 g、紅花10 g、蒲公英30 g、穿山甲3 g、柴胡6 g、白芍10 g、香附10 g、山藥10 g、青皮10 g、陳皮10 g、路路通10 g、通草10 g。中藥飲片由石家莊市中醫院中藥房提供，濃縮成生藥濃度為3.4 g/mL的中藥液。

1.1.3 試劑與儀器 GM-CSF試劑盒(上海森雄科技事業有限公司，批號：SXR006)、IL-4試劑盒(上海森雄科技事業有限公司，批號：SXR030)；核因子κB antibody(北京博奧生物，批號：bs-0465R)；ABC Kit(Vector公司，美國，批號：PK-4002)；DAB Kit(北京中杉金橋，批號：zlI-9610)。顯微鏡(Olympus Corporation，日本，型號：DP73)；離心機(上海安亭，型號：TDL-5-A)；酶標儀(雷勃公司，芬蘭，型號：MK3)；恒溫振蕩器(常州國華，型號：SHA-B)；顯微圖像分析系統(武漢同濟醫科大學，型號：HMIAS-2000)；實時熒光定量PCR儀(美國ABI，7500fast)；基因擴增儀(PE公司，美國，型號：PE～9600)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 SD大鼠適應性飼養5 d，連續進行陰道脫落細胞學涂片，光鏡下觀察，篩選動情周期正常的雌性大鼠125只進入正式實驗。機械損傷聯合化學燒傷造模[4]。除空白組(17只大鼠)外，其余大鼠進行造模，術前禁食水12 h，稱重，10%的水合氯醛以大鼠體質量300 g/mL腹腔注射麻醉，麻藥起效后，固定、備皮、消毒，于大鼠下腹正中作1 cm左右大小的切口，尋找并暴露子宮。用1 mL注射器取25%的苯酚膠漿劑，自藥效組大鼠左側子宮進針，向輸卵管—卵巢方向緩慢注入苯酚膠漿0.06 mL。生殖組大鼠自雙側子宮分別進針，向雙側輸卵管—卵巢方向緩慢注入苯酚膠漿各0.06 mL，造模過程中用注射器針頭輕輕劃傷大鼠宮內膜，夾閉針孔防止溶液流出，切口縫合、消毒，抬高大鼠臀部防止膠漿流出，待大鼠蘇醒。造模過程中隨機選取6只大鼠，取子宮組織，蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色，造模第10天，光鏡下觀察大鼠出現子宮腔壁增厚，組織結構紊亂，腺體紊亂萎縮變形，可見大量炎細胞浸潤，內膜充血水腫等病理改變情況，以確定造模成功。按照隨機數字表法進行分組，分為模型組、高氏盆炎方三號高、中、低劑量組(中藥高、中、低劑量組)、蒲苓組、胎盤組；藥效組每組10只，生殖組每組7只(共119只大鼠)。

1.2.2 給藥方法 空白組(自由食水)模型組給與生理鹽水1 mL/100 g，高氏盆炎方三號高、中、低劑量組每天分別給予34 g/kg、17 g/kg、8.5 g/kg高氏盆炎方三號藥液(以生藥計，根據每千克體質量用藥量的人鼠比例換算)；蒲苓組給予3 g/kg蒲苓盆炎康顆粒，胎盤組肌內注射人胎盤組織液1 mL/kg，連續用藥20 d。

1.2.3 合籠方法 給藥20 d后，觀察大鼠動情周期，按照雌雄比7﹕2進行合籠，即每7只雌性大鼠隨機與2只健康同周齡雄鼠關在同一籠子里交配[5]。由于大鼠性周期為4～5 d，其孕期19～23 d，平均21 d，以同籠飼養試受孕時間60 d為限(即大鼠12個動情周期)。每天上午8:00開始進行陰道涂片觀察及陰栓檢查，并描述、記錄觀察內容。觀察各組大鼠受孕情況，受孕成功的雌鼠單獨喂養，而雄鼠仍可與其余雌鼠交配。

1.2.4 檢測指標與方法

1.2.4.1 藥效組 1)在末次給藥治療24 h后，麻醉大鼠(10%水合氯醛)，腹主動脈取血后離心10 min(3 000 r/min，r=10 cm)，取上層血清；分離大鼠雙子宮稱重，后取左側部分組織置于多聚甲醛中固定保存，一部分裝到EP管中，-80 ℃留存待測。2)取大鼠雙側子宮組織，稱濕質量，計算子宮腫脹度(子宮腫脹度=左側子宮質量-右側子宮質量；抑制率模型組子宮平均腫脹度-給藥組子宮平均腫脹度/模型組子宮平均腫脹度×100%。將左側子宮組織標本固定、包埋、切片，染色，光鏡下觀察病理改變[6-7]。3)酶聯免疫吸附試驗法法檢測血清粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony StimulatingFactor，GM-CSF)、白細胞介素(Interleukin，IL)-4水平。嚴格按試劑盒說明書逐步操作進行檢測。4)免疫組織化學法和實時定量PCR測定核因子κB蛋白和基因表達。5)核因子κB蛋白表達：將石蠟切片脫蠟水化，磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)溶液洗3次(5 min)，于3% H2O2溶液(室溫中)靜置15 min后PBS洗3次(5 min)；非免疫血清封閉40 min；加已稀釋I抗(4 ℃過夜)→復溫→PBS洗3次(5 min)；加已稀釋Ⅱ抗，37 ℃孵育20 min，PBS洗3次(5 min)；加SP，37 ℃孵育15 min，PBS洗3次(5 min)；加入顯色劑(DAB)顯色(5 min)后自來水沖洗，蘇木精復染、脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察，拍照，用HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統計算平均光密度值(IOD)，陽性表達則可見棕黃色或棕褐色顆粒染色部位。6)核因子κB mRNA表達水平：取-80 ℃留存大鼠子宮組織粉碎搖勻添加RNA提取試劑，提取總RNA，測RNA濃度后，取總RNA 2 μg，先在含寡dT纖維素引物、脫氧核苷三磷酸的混合液中65 ℃ 5 min使模板RNA變性后，冰上迅速冷卻。添加反轉錄反應液(包括PrimeScript II Buffer，PrimeScript II RTase，Rnase Inhibitor等)，用焦碳酸二乙酯水將反應液容積增至20 μL，緩慢搖勻后離心，置于PCR儀中，42 ℃靜置45 min合成cDNA，95 ℃置5 min使酶失活，冷卻后于-20 ℃保存備用。使用兩步法反應程序，95 ℃，10 min預變性；而后40個循環反應：95 ℃ 15 s。進行RT-PCR結果分析，擴增完畢后，得到核因子κB基因及內參基因GAPDH的Ct值，△Ct=核因子κB基因的Ct值-內參基因GAPDH的Ct值，得出核因子κB基因的Q值及Q均值(Q=2-△Ct)，最后求得所需的RQ值(即核因子κB基因表達的相對定量值，RQ=Q值/Q均值)，將RQ統計分析。

1.2.4.2 生殖組 觀察60 d(約大鼠12個動情周期)內各組大鼠一般情況，受孕率，產仔數等變化。

表1 引物序列

2 結果

2.1 藥效學實驗結果

2.1.1 各組大鼠子宮組織病理學表現 空白組：子宮壁結構清晰完整，腺體完整，子宮內膜無充血及水腫，未見炎癥細胞。模型組：子宮腔壁增厚，組織結構紊亂，腺體紊亂萎縮變形，可見大量炎癥細胞浸潤，內膜充血水腫明顯。中藥高劑量組：炎癥細胞浸潤較少，余同空白組。中藥中劑量組：部分腔壁稍增厚，內見少量炎癥細胞輕度浸潤，稍有內膜充血、水腫。中藥低劑量組及蒲苓組：腔壁輕度增厚，結構雜亂，內膜充血、水腫，全層可見炎癥細胞浸潤。胎盤組：部分可見少量炎癥細胞浸潤。

圖1 光鏡下各組大鼠子宮形態學變化(HE染色，×400)

2.1.2 各組大鼠血清GM-CSF、IL-4的水平比較 與模型組比較，其余各組大鼠血清GM-CSF水平均明顯降低，IL-4水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；中藥高劑量組血清GM-CSF及IL-4水平與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；中藥中、低劑量組大鼠與空白組大鼠比較，血清GM-CSF水平升高，血清IL-4水平降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)；中藥高劑量組與蒲苓組及胎盤組比較，GM-CSF表達降低，IL-4水平明顯升高，差異均有統計學意義(均P<0.05)；中藥中、低劑量組大鼠血清GM-CSF及IL-4水平與蒲苓組及胎盤組比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清GM-CSF、IL-4的水平比較

2.1.3 各組大鼠子宮組織核因子κB蛋白及mRNA表達水平比較 與模型組比較，其余各組大鼠子宮組織核因子κB蛋白及核因子κB mRNA表達明顯降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)；與空白組比較，中藥低劑量組大鼠子宮核因子κB蛋白及核因子κB mRNA表達明顯上升，差異均有統計學意義(均P<0.05)；空白組大鼠子宮組織核因子κB蛋白及核因子κB mRNA表達水平與中藥高、中劑量組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；中藥高、中、低劑量組大鼠子宮組織核因子κB蛋白及核因子κB mRNA表達水平與胎盤組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；中藥高劑量組大鼠子宮組織核因子κB蛋白及核因子κB mRNA表達水平降低，與蒲苓組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；蒲苓組大鼠子宮組織核因子κB蛋白及核因子κB mRNA表達水平與高氏盆炎方三號中、低劑量組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3及圖2。

表3 各組大鼠子宮組織核因子κB蛋白及基因表達水平

圖2 各組核因子κB蛋白表達(免疫組織化學染色，×400)

2.2 生殖組實驗結果

2.2.1 第1～10天受孕率 觀察雌雄合籠第1～10天(即大鼠2個性周期)受孕情況，空白組受孕率為100%，模型組受孕率為0，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，中藥高、中低劑量組及胎盤組第1～10天受孕率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；中藥高、中、低劑量組第1～10天受孕率與對照組、胎盤組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與其他各給藥組比較，蒲苓組第1～10天受孕率低于中藥各劑量組，且較空白組及中藥組受孕時間后延。

2.2.2 總妊娠率 試受孕60 d后，模型組7只雌鼠仍未受孕，與模型組比較，各給藥組60 d的總體妊娠率明顯升高，差異均有統計學意義(均P<0.05)；中藥高、中、低劑量組及胎盤組大鼠60 d內全部受孕，妊娠率達到100%，蒲苓組僅有1只未孕，總妊娠率達到85.7%(1只受孕中期死亡，但總妊娠率仍明顯高于模型組)。見表4。

表4 生殖組各組大鼠受孕率情況(%，n=7)

2.2.3 子鼠情況 模型組受孕率為0，產子數為0?？瞻捉M、中藥高劑量組產仔數、平均產仔數較多，各組子鼠存活率較高(93.1～98.7%)。各組平均產仔數與模型組比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)；中藥中、低劑量組平均產仔數低于空白組，差異均有統計學意義(均P<0.05)，空白組平均產仔數與中藥高劑量組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 生殖組各組大鼠子數情況(n=7)

3 討論

近年CPID發病率逐年上升，為婦科常見及多發病。而不孕癥是指男女雙方同居1年以上，有正常的性生活且未采取任何避孕措施，女性仍未受孕，或曾有過妊娠，之后未避孕1年以上而未再妊娠。不孕癥是婦科常見、多發且難治性疾病。不孕癥的病因復雜多樣，近年來隨著人工流產術等宮腔操作次數的增加、工作節奏的加快、急性盆腔炎未能得到及時有效治療以及性傳播疾病的增加，導致盆腔炎性不孕的發病率也隨之上升，其中PID是導致輸卵管性不孕的主要原因。西醫治療PID在急性期以抗生素治療為主，后期常采用手術或輔助生殖技術治療，西醫手術治療可縮短治療時間，但對機體損害相對較大，輸卵管疏通后仍有再次粘連或堵塞的風險。中醫多靶點治療可促進患者整體恢復、預防術后并發癥，提高受孕率。在治療盆腔炎及盆腔炎性不孕有其獨特優勢。

中醫認為本病關鍵是“瘀”，“瘀”既是疾病的病理產物，又是致病因素，病機為邪(寒熱濕毒)阻沖任氣機，氣滯血瘀，胞脈瘀阻不通。高氏盆炎方三號重用活血化瘀、軟堅散結，消癥通絡的皂角刺、穿山甲、當歸、紅花、路路通起到抗粘連作用。葉天士曾云“女子以肝為先天”，方中柴胡、白芍、香附、青皮行氣疏肝，調情志，主要針對女性生理特點，且因肝脈過陰器，又有“經脈所過，主治所及”，選用入肝經中藥，引藥入位，可治療盆腔疾病，疏通輸卵管治療不孕?，F代藥理研究表明，理氣藥能夠對抗滲出和增生性炎癥，增強機體的免疫力，又具明顯鎮痛作用[8]。方中山藥、陳皮能調和脾胃以祛濕，一則健脾扶正，正氣強則邪氣消，提高機體免疫力，防止慢性炎癥急性發作；二則脾胃強則能受納藥物(防止活血化瘀、軟堅散結藥損傷脾胃)。另外加入具有清熱解毒之功的蒲公英、通草，起到抗炎作用，避免慢性炎癥急性發作導致疾病進展。研究表明，清熱解毒類中藥有多種抗炎成分，它們通過多種途徑發揮抗炎作用[9]。高氏盆炎方三號切中病機，臨床中除用來治療CPID外，在治療CPID合并輸卵管阻塞和輸卵管阻塞性不孕癥等方面具有優勢。

CPID存在不同程度的炎癥損傷，前期以組織充血、腫脹、滲出等病理改變為主，后期會呈現不同程度增生、粘連及瘢痕的表現，不僅容易造成盆腔粘連，還容易造成輸卵管粘連阻塞，最終導致不孕發生。高慧教授[10]根據其病理特點將前者定義為“濕性炎癥”，如盆腔積液，輸卵管積液、積膿，后者則稱為“干性炎癥”，如盆腔粘連、輸卵管不通，輸卵管阻塞等。本實驗中，藥效實驗結果顯示，各給藥組較模型組大鼠子宮腫脹度減輕，光鏡下觀察模型組可見明顯炎細胞浸潤，內膜充血水腫，子宮腔壁增厚，組織結構紊亂，腺體紊亂萎縮變形，提示造模成功，各給藥組大鼠的病理表現有不同程度的改善。

在CPID細胞因子網絡中，核因子κB的活化是一中心環節，核因子κB是介導機體炎癥反應的信號通路，受到物理創傷、細胞因子刺激后被激活，從而啟動和調控炎癥細胞、黏附分子等參與炎癥反應過程(其中包括炎癥介質GM-CSF)，進一步擴大炎癥反應，并通過炎癥反應加重組織損傷[11-14]。有研究指出核因子кB參與組織纖維化(肺、肝等)，與宮腔粘連密切相關[15]。GM-CSF是在炎癥反應過程中由損傷內皮細胞釋放出的一種炎癥反應的敏感性標志物，與CPID密切相關[16]。核因子κB的活化可上調GM-CSF的表達，通過核因子κB失活抑制了GM-CSF生成[17-18]。IL-4主要由Th2細胞產生的免疫抗炎因子，在炎癥反應中，隨著IL-4水平的逐漸升高，其抑炎作用增強，炎癥介質被抑制，恢復體內自身的免疫動態平衡[19]。既往已有研究表明，IL-4能夠負調控核因子κB通路抑制炎癥反應[20-23]。本研究結果表明，與模型組比較，高氏盆炎方三號各劑量組大鼠血清GM-CSF水平均降低；IL-4水平均升高，子宮組織核因子κB蛋白及基因表達下調，說明了中藥發揮免疫抗炎作用，通過升高IL-4的水平，提高了機體免疫力，抑制核因子ΚB活性，阻斷炎癥信號通路傳導，從而下調GM-CSF水平，抑制了炎癥介質激活釋放，最終降低炎癥反應，從而修復大鼠子宮組織結構、病理損傷，預防和抗粘連，改善盆腔炎癥結局。

本研究通過觀察生殖觀察組不孕大鼠模型，結果表明，模型組60 d(大鼠以5 d為一個性周期，12個周期為60 d)總體妊娠率為0，而藥物觀察組均受孕產子，其受孕率、產仔數、平均產仔數、存活率較高。主要考慮以下3方面因素影響受孕：1)因炎癥改變盆腔內環境；2)炎癥導致輸卵管炎癥及輸卵管阻塞；3)炎癥經輸卵管蔓延至卵巢(大鼠動情周期改變)，影響卵巢功能；其中任何一個環節出現問題均可能導致不孕發生。本研究模型組雌鼠均未受孕也再次證明了盆腔炎模型制備成功(無論是子宮體炎、輸卵管炎、輸卵管炎性阻塞、卵巢炎均屬于盆腔炎)。經高氏盆炎方三號治療后大鼠受孕率明顯升高，且產仔只數較模型組明顯增多，治療效果理想，提示高氏盆炎方三號可有效改善盆腔炎大鼠的生殖功能，一方面因盆腔炎的治愈，控制了輸卵管炎和卵巢炎，疏通輸卵管炎性阻塞，而最終起到治療炎性不孕的效果，達到他病愈則自能成孕。另一方面通過抗炎，抑制CPID癥進一步擴散，起到預防損傷進一步進展，提高了妊娠率和治療效果。運用倒查機制，以受孕成功說明炎癥粘連恢復，盆腔內環境恢復。

綜上所述，高氏盆炎方三號對CPID及炎性不孕大鼠有良好的治療作用，其作用機制可能是通過促進抗炎細胞因子IL-4分泌水平，提高機體免疫力，恢復體內自身的免疫動態平衡，抑制核因子κB通路的激活，進而降低炎癥介質GM-CSF釋放，減輕子宮炎癥反應，減少CPID的損害，預防粘連發生，改善大鼠子宮組織病理形態，提示高氏盆炎方三號能夠有效治療CPID。同時通過治療盆腔炎癥(包括治療輸卵管炎和卵巢炎；疏通輸卵管炎性阻塞，恢復卵巢排卵功能)，抑制盆腔炎癥進一步進展，恢復盆腔內環境，修復因炎癥造成的盆腔生殖功能的損傷，提高CPID大鼠受孕率及妊娠率，為臨床應用高氏盆炎方三號治療CPID及炎性不孕提供了更多的理論依據。