壯藥扶正方對TAMs與腫瘤細胞共培養體系A549細胞生物學行為的影響

張順榮 莫娟梅 甘芷川 李瓊謙 李嬋娟 鄭 盼 梁 瀟 唐偉智 唐 璜 蘇 運 文海迪 黃振飛

(1 廣西國際壯醫醫院腫瘤科，南寧，530201；2 廣西中醫藥大學，南寧，530200)

雖然近年來肺癌的診斷水平及治療效果取得長足進展，但總體5年生存率仍僅有15%左右[1]。近些年來，肺癌一直是世界范圍發病率及死亡率最高的惡性腫瘤，嚴重危害人類健康和生命[2]。隨著免疫治療在腫瘤領域接連取得重大突破，從免疫角度探索新的肺癌治療模式越來越受到重視。作為腫瘤免疫細胞浸潤微環境中優勢群體，腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated Macrophages，TAMs)通常表現出免疫抑制的M2表型，已經證實其能促進腫瘤生長、血管生成、進展、轉移和免疫抑制[3-4]。越來越多科研工作者開始重視制定策略來改變TAMs以阻止肺癌的進展，如促進從M2復極化到M1亞型，或防止基質環境中TAMs的M2極化，這為腫瘤免疫治療提供了一個新靶點。

中醫藥在我國肺癌治療中扮演著重要角色，現代研究表明中藥單體或復方均在一定程度上調節肺癌免疫微環境[5-7]。腫瘤的發生、進展、治療及預后的全程中通常伴隨著正虛表現，故“扶正”為主的治則治法應貫穿肺癌診治的全過程[8]。從免疫微環境角度觀察“扶正法”治療腫瘤的病機具有重要的臨床意義。

壯醫藥歸屬中醫藥范疇，在肺癌防治中扮演重要角色。目前，關于壯藥復方作用TAMs發揮抗腫瘤的研究尚少。我們前期臨床觀察發現壯藥扶正方能夠提高肺癌患者生命質量、增強患者免疫力、延長生存期[9]。為進一步探討壯藥扶正方治療肺癌的可能機制，本研究采用上清共培養模型模擬腫瘤微環境，觀察壯藥扶正方含藥血清對共培養體系A549細胞生物學行為的影響，探討其抗腫瘤的免疫機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細胞 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級SD大鼠40只，體質量(200±20)g，雌雄各半，購自廣西醫科大學實驗動物(生產許可證號：SCXK桂2014-0002)，于SPF級動物房進行飼養，飼養條件：溫度20～24 ℃，相對濕度40%～60%，12 h明暗循環，標準飼料和水喂養。本實驗過程符合中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定，且通過廣西國際壯醫醫院動物倫理委員會審查(倫理審批號：【2021】-041)。人急性白血病單核細胞株THP-1和人肺癌細胞株A549均購自深圳銳奧博生物科技有限公司。

1.1.2 藥物 五指毛桃飲片、黃花倒水蓮飲片、黃芩飲片均購自廣西國際壯醫醫院民族藥房，且經廣西中醫藥大學藥學院教研室鑒定為地道藥材，符合質量標準，并由廣西國際壯醫醫院民族藥制劑室制成濃縮浸膏，1 g浸膏相當于生藥量6 g，灌裝滅菌，置于4 ℃冰箱中備用。

1.1.3 試劑與儀器 主要試劑：RT-PCR試劑盒(康為世紀，貨號：CW2677)；白細胞介素-10[愛必信(上海)生物有限公司，貨號：abs551807]；白細胞介素-12[愛必信(上海)生物有限公司，貨號：abs510012]、MTT試劑盒(Sigma公司，美國，貨號：M2128)；Trans-well共培養小室(Corning公司，美國，貨號：3422)。主要儀器：CIM-plate16細胞遷移檢測板[艾森生物(杭州)有限公司，型號：05665817001]；多功能酶標儀(BioTek公司，美國，型號：SynergyHTX)；臺式冷凍離心機(SIGMA公司，德國，型號：TGL-16gR)；熒光PCR儀[伯樂生命醫學產品(上海)有限公司，美國，型號：CFX96 Touch]；實時細胞分析儀(ACEA Biosciences公司，美國，型號：RTCA DP)。

1.1.4 含藥血清制備 依據隨機數字表將SD大鼠分成4組，分別為生理鹽水對照組、壯藥扶正方高劑量組4.474 g、壯藥扶正方中劑量組2.237 g、壯藥扶正方低劑量組1.119 g，每組10只。壯藥扶正方組灌胃2 mL/次，2次/d(9am，4pm)，連續7 d。空白對照組灌服等量生理鹽水。末次給藥后1 h行腹主動脈采血，同組大鼠的血液混勻后合裝，56 ℃水浴30 min后取出，放入4 ℃冰箱過夜，凝固后經離心(重力加速度17 000×g)，15 min后收集上清，0.22 μm濾膜過濾除菌，標記，置于-80 ℃冰箱貯存備用。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測含藥血清對TAMs細胞增殖的影響 參考文獻[10-11]建立TAMs體外模型，取對數生長期細胞(活力>95%)以1×106細胞接種于96孔培養板內，每組設置6孔，同時設3個復孔，每孔200 μL，用無血清RPMI-1640培養細胞24 h處于G0期。然后用各組含藥血清培養細胞24 h、48 h、72 h后更換培養液，按MTT試劑盒操作完成實驗，采用多功能酶標儀檢測各孔的吸光度(A)值。根據公式計算每組平均抑制率(IR)，并繪制細胞抑制率曲線IR=1-A藥物組均值/A對照組均值×100%。

1.2.2 實時定量PCR檢測含藥血清干預TAMs后白細胞介素-10、白細胞介素-12、誘導型一氧化氮合酶及CD206基因表達 采用Trizol法分別提取各組含藥血清干預后的細胞各個時段總RNA，測定其濃度及純度，再將總RNA逆轉錄為cDNA，在qPCR儀上進行白細胞介素-10、白細胞介素-12、誘導型一氧化氮合酶及CD206基因檢測，所需引物序列見表1。

表1 熒光定量qPCR引物序列

1.2.3 ELISA檢測細胞因子表達 按照ELISA試劑盒說明書操作檢測細胞因子白細胞介素-10、白細胞介素-12含量，采用多功能酶標儀檢測各孔的吸光度(A)值，計算細胞因子的質量濃度。

1.2.4 MTT法檢測上清共培養體系中A549細胞增殖水平 將培養至對數生長期的肺癌A549細胞用0.25%胰酶消化，調整濃度為1×106細胞/L接種于96孔板，每孔200 μL，培養24 h貼壁。更換培養液，分為5組：空白對照組(A549)、共培養組(A549+TAMs)、壯藥扶正方低、中、高劑量組(A549+TAMs+壯藥扶正方含藥血清低、中、高)。處理24、48、72 h后每孔加入MTT工作液20 μL，置于37 ℃、5% CO2條件下繼續孵育4 h，離心(重力加速度17 000×g)吸去上清液，每孔加入150 μLDMSO，搖床低速振蕩10 min。采用多功能酶標儀測各孔的吸光度(OD)值，并計算抑制率。

1.2.5 實時細胞分析技術(RTCA)檢測含藥血清對上清共培養體系中A549細胞遷移的影響 參照文獻[12]，在CIM-Plate 16孔板的下板中加入含血清培養基165 μL，同時快速組裝上板并于上板內加入無血清培養基30 μL，并將其放入培養箱平衡30 min測基線。胰酶消化肺癌A549細胞，調整濃度為1×106細胞/L，每孔加入100 μL，6 h貼壁后吸去同量上層培養液，空白對照組加入無血清培養基，共培養組加入TAMs上清，壯藥扶正方各劑量組加入不同壯藥扶正方藥物濃度處理TAMs上清各100 μL。每組設3個復孔，37 ℃ 5% CO2恒溫培養箱培養，RTCA-DP儀器實時監測72 h。

1.2.6 Transwell實驗檢測上清共培養體系中A549細胞侵襲能力 將基質膠(Matrigel)在4 ℃提前1 d融化，室溫過夜液化稀釋為工作液，加入Transwell小室底部膜上室，37 ℃培養箱培養30 min膠化Matrigel；空白對照組、共培養組、壯藥扶正方低、中、高劑量組按照每孔5×103個的密度接種于上層腔室，在下層培養基中加入空白血清1640培養基。置于37 ℃ 5% CO2恒溫培養箱培養24 h、48 h、72 h，取出小室，用PBS洗滌1次，70%冰乙醇溶液固定1 h，棄70%乙醇溶液，每孔加入0.1%結晶紫溶液1 mL，染色30 min后用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)洗3次，晾干。用棉簽小心擦去小室內沒有遷移的細胞，在倒置顯微鏡下拍照、計數。

2 結果

2.1 壯藥扶正方含藥血清對TAMs細胞增殖活力的影響 與空白對照組比較，壯藥扶正方含藥血清低、中、高劑量組在分別刺激TAMs細胞24 h、48 h、72 h后的OD值均降低，并與刺激時長負相關(P<0.05，P<0.01)。抑制率(IR)依次升高并與刺激時長正相關。見表2、圖1。

表2 壯藥扶正方含藥血清對TAMs增殖的影響

圖1 不同劑量壯藥扶正方含藥血清對TAMs增殖的影響

2.2 壯藥扶正方含藥血清干預TAMs后能夠調節其表型改變 與空白對照組比較，壯藥含藥血清處理各劑量組均能下調M2型標志物CD206、白細胞介素-10的mRNA相對表達量(P<0.05，P<0.01)，上調M1型標志物誘導型一氧化氮合酶、白細胞介素-12的mRNA相對表達量(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性；同時各表型基因表達水平具有一定時間依賴性，在48 h時明顯變化。見表3、圖2。結果表明不同劑量的壯藥扶正方含藥血清能明顯上調細胞因子白細胞介素-12的表達(P<0.01)，同時下調白細胞介素-10的表達(P<0.01)。見圖3。

表3 不同劑量的壯藥扶正方含藥血清對TAMs指標的影響

圖2 不同用藥時間對TAMs中CD206、白細胞介素-10、誘導型一氧化氮合酶、白細胞介素-12基因表達的影響

圖3 各組細胞因子白細胞介素-10、白細胞介素-12的表達量比較

2.3 壯藥扶正方含藥血清對上清共培養體系中A549細胞增殖的影響 經低、中、高劑量組壯藥扶正方含藥血清處理的TAMs，取不同上清作用A549細胞24 h、48 h、72 h，觀察其增殖情況。與空白對照組比較，共培養組肺癌A549細胞增殖水平增加(P<0.01)；與共培養組比較，含藥血清各劑量組肺癌A549細胞的增殖水平下降(P<0.05)，呈劑量依賴性。見圖4。

圖4 不同劑量的壯藥扶正方含藥血清對上清共培養體系A549細胞增殖的影響

2.4 壯藥扶正方含藥血清對上清共培養體系中A549細胞遷移能力影響 與空白對照組比較，共培養組A549細胞遷移能力明顯增強(P<0.01)；與共培養組比較，壯藥扶正方含藥血清各劑量組A549細胞遷移能力明顯降低，與48 h后比較差異有統計學意義，且呈量效關系(P<0.05)。見圖5。

圖5 壯藥扶正方含藥血清對共培養體系中A549細胞遷移的時效關系

2.5 壯藥扶正方含藥血清對上清共培養體系中A549細胞侵襲的影響 根據Transwell實驗可看出，空白對照組穿過小室細胞數為(286±18)個，共培養組穿過小室細胞數為(553±24)個，經由不同濃度壯藥扶正方含藥血清共培養的TAMs處理后的A549細胞穿過小室的細胞數為分別為(509±20)個、(318±38)個、(204±24)個。與空白對照組比較，共培養組細胞明顯增多；與共培養組比較，藥物組細胞明顯減少(P<0.01)，且呈劑量依賴性。見圖6。說明壯藥扶正方含藥血清能夠通過調節TAMs表型來抑制A549細胞侵襲。

圖6 壯藥扶正方含藥血清對共培養體系中A549細胞侵襲的影響(結晶紫染色，×100)

3 討論

《外證醫案》云：“正氣虛則成巖。”《醫宗必讀》說：“積之成也，正氣不足而后邪氣踞之。”《靈樞·刺節真邪》說腫瘤為“虛邪之入于身也深，寒與熱相搏,久留而內著”。以上論述均說明“正虛”是引起肺癌發生的內在因素。有研究通過統計學方法分析肺癌常用中藥頻率，結果顯示如黃芪、人參等補益藥為治療肺癌的首要核心藥物，說明“扶正”為治法應貫穿肺癌治療全程[13]。研究表明，中醫藥的扶正作用在調控肺癌免疫微環境方面發揮重要作用[14-16]。因此應從抗癌中藥(含民族藥)中尋找具有調控TAMs潛力單體或復方，為肺癌綜合治療提供新的治療策略。

現代研究表明五指毛桃、黃花倒水蓮、黃芩能夠調節腫瘤患者免疫功能，具有一定抗腫瘤作用[17-20]。作為壯藥扶正類藥物，五指毛桃、黃花倒水蓮、黃芩的藥效很多，其化學成分的研究已經比較詳細，但是對其藥理作用的研究雖有涉及，卻欠完備，如對其扶正功效在巨噬細胞介導的腫瘤免疫微環境研究甚少。本文通過構建共培養模型，模擬腫瘤免疫微環境，進一步研究壯藥扶正方抗腫瘤的作用機制。

本實驗結果顯示，不同濃度的壯藥扶正方含藥血清可以上調體外誘導的TAMs中M1型標志物，如白細胞介素-12、誘導型一氧化氮合酶，同時下調M2型標志物，如白細胞介素-10、CD206。在上清共培養系中，共培養組A549細胞明顯增殖，遷移、侵襲作用增強；而經藥物處理過的TAMs上清能夠抑制A549細胞增殖，遷移侵襲作用也受抑制。本研究提示，壯藥扶正方可能是通過調節TAMs表型影響A549細胞的生物學行為。但復方成分復雜，通過對免疫微環境的調節發揮抗腫瘤機制的成分尚不明確，有待進一步研究證實。