微生物分子生態學研究方法概述

劉 再，燕亞平，崔金娜，胡建華，李永麗，朱明達，劉占英,

（1.內蒙古自治區發酵產業節能減排工程技術研究中心，生物發酵綠色制造內蒙古自治區工程研究中心，內蒙古工業大學化工學院，內蒙古呼和浩特 010051）

微生物生態學是基于微生物群體的科學，利用微生物群體DNA/RNA 等標志物，重點研究微生物群落構建、組成演變、多樣性及其與環境的關系，在生態學理論的指導和反復模型擬合下由統計分析得出具有普遍意義的結論。隨著研究的深入，傳統的技術在非可培養微生物研究方面存在一定局限性，分子生物學研究技術被借鑒到微生物生態學研究中，在物種遺傳多樣性、分子適應性、變異分子機制及其進化意義等基礎理論方面取得了突破。

目前環境微生物生態學主要研究環境中存在哪些微生物和分析微生物在環境中的作用兩個方面，此外，微生物之間以及微生物與環境因子之間的相互作用受到越來越多的關注。近十幾年來，微生物多樣性以及群落結構的研究一直沿用傳統分離、培養、鑒定并描述特征的方法，然而，研究證實自然界中有85%～99.9%的微生物至今還不可純培養。隨著環境微生物DNA 提取方法的不斷改進，以核酸為依據對微生物進行分類方面的研究獲得了較大發展，涌現出許多微生物分子生態學研究方法，如變性梯度凝膠電泳、末端限制性長度多態性、熒光原位雜交技術、實時熒光定量PCR 技術、擴增子測序技術、宏基因組學、宏轉錄組學、功能基因組學、基因芯片等，常用微生物分子生態學研究方法的優缺點見表1。

表1 微生物分子生態學研究方法比較Table 1 Comparison of research methods of microbial molecular ecology

本文基于前人的研究工作，綜述了微生物分子生態學的研究方法，以期為客觀地認識、分析和利用微生物群落乃至微生物生態系統提供技術參考。

1 傳統方法

常用微生物分子生態學研究方法中的分離培養法、Biolog 微平板法和PLFA 圖譜分析均屬于傳統方法，即環境微生物數據是通過分析微生物生長的物質獲得的，如液體培養物中的細胞或通過涂布獲得的菌落，以及微生物代謝所產生的物質和微生物自身的組成部分。

1.1 分離培養法

傳統微生物培養法是將所獲得樣本中的微生物進行分離、提純、鑒定后通過肉眼觀察其特征，以此來區分樣本中菌群的結構。由于傳統的純培養法只能在實驗室進行，且僅能區分環境中低于10%的微生物種類，因而得到的結果不能完全反映環境微生物具體的生態多樣性，且該方法耗時較長。

1.2 Biolog 微平板法

Biolog 微平板法是通過微生物利用碳源進行呼吸產生NADH，并與底物中的還原染料發生反應所產生的顯色效應來鑒別菌種。Biolog 微平板法可用于環境微生物群落的研究，Ei-Liethy 等分別使用Biolog Gen III 系統和聚合酶鏈式反應分離和鑒定水槽排水管中的芽孢桿菌，證實PCR 對枯草芽孢桿菌的鑒定比Biolog 更敏感，采用分子方法可以彌補Biolog微平板法在鑒定細菌分離物上的不足。Morgan 等使用159 株臨床分離株對Biolog 鑒定系統和16S核糖體RNA 基因測序方法進行了評估，結果表明：16S rRNA 基因測序提供了更準確的非典型細菌鑒定方法，對于鑒定挑剔的革蘭氏陰性桿菌類別的生物時，確定Biolog 系統存在缺陷。Biolog 微平板法具有以下特點：測定簡便，具有可重復性；無需分離培養純種環境微生物；Biolog 平板中的碳源和介質的pH 可能不能代表土壤中存在的碳源和pH 情況；不能全面了解樣本中微生物群落結構，還應采用其他研究方法。

1.3 PLFA 圖譜分析

PLFA 圖譜分析又稱磷脂脂肪酸圖譜分析，它將磷脂作為存活微生物群落的標記物，利用氣相色譜分析，并與已知數據庫（厭氧菌庫、酵母菌庫等）對比即可得到環境樣品中微生物的生物量和群落結構信息。

PLFA 圖譜分析可用于土壤種群多樣性的研究。Chen 等在研究模擬的春季降水后土壤微生物群落組成的短期變化過程中發現基于不同微生物生物標記物（PLFA 與DNA）方法的組合使用，結果卻相互一致，但基于PLFA 的方法更為敏感，基于DNA的方法則可以提供更精細的微生物類群信息。Orwin等測試了PLFA 剖面法和16S rRNA 基因元編碼這兩種技術在量化五種土地利用之間細菌群落結構差異的相對能力，結果發現雖然兩種方法得出的結果具有一致性，但是16S rRNA 基因元編碼在靈敏度上將更勝一籌。該方法突破了原有的微生物分離培養的限制，依靠簡單快速的分析程序和不使用特殊的設備，贏得了廣大研究者們的青睞，但是僅限于屬的水平，且受到提取方法和環境pH 動態變化的影響，所以用于特異微生物類群的鑒定結果還不夠準確，應結合其他方法以提高鑒定結果的準確性。

2 DNA 指紋圖譜法

DNA 指紋圖譜法即使用基因探針與DNA 酶切片段進行雜交，獲得由多個位點上的等位基因組成的長度不等的雜交帶圖紋，并通過數據分析得出結論。

2.1 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

變性梯度凝膠電泳（DGGE）因具有高效且操作簡單的特點，極大地拓展了對環境中不可培養微生物的發現，但是它具有譜帶重疊的缺陷，導致其成為一種低分辨率的分析方法，因此該方法不是一種普適的分析方法，只能作為研究菌群結構的輔助手段之一，故需要結合指紋圖譜技術和測序技術作進一步的鑒定分析，后者通過克隆、測序建立微生物區系的16S rRNA/rDNA 文庫。通過系統發育分析，建立進化樹，從而獲得微生物多樣性分析，但這種方法相對于指紋圖譜技術來說，價格昂貴。其原理見圖1，該方法根據DNA 的解鏈特性，不同堿基組成的DNA在聚丙烯酰胺凝膠電泳時會產生不同的電泳遷移速率，從而使不同DNA 分子得以分離。

圖1 變性梯度凝膠電泳（DGGE）原理圖Fig.1 Schematic diagram of denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）

PCR-DGGE 技術因在提取DNA 后能夠直接提供環境樣本中細菌群落的指紋而被微生物生態學廣泛應用，Xiong 等使用DGGE 和高通量測序（HTS）來研究嬰兒配方粉生產主要階段中的細菌群落結構和分布，雖然HTS 和DGGE 在反映優勢菌群變化方面上不分伯仲，但是HTS 在反映細菌群落豐富度方面上更勝一籌。Chahorm 等驗證了PCR-DGGE在快速檢測食品中弧菌種類上的可行性。Bo 等利用擴增子測序技術和DGGE 對緬甸傳統發酵茶葉中細菌和真菌的多樣性進行分析，雖然兩種方法在該項研究中具有很高的相似性，但是DGGE 因很難檢測到小于10CFU/g 樣品中微生物的種群，導致其多樣性分析結果較差。PCR-DGGE 技術是微生物分子生態學技術中最常用的方法之一，但該方法與高通量測序技術等其他方法相比，在檢測豐度和檢測限度上具有明顯的缺點，同時樣本的處理、DNA 的提取、PCR 擴增的缺陷都會影響檢測結果，故需要結合其他分子生物手段進行分析。

2.2 末端限制性長度多態性（T-RFLP）

末端限制性長度多態性又稱為16S rRNA 基因的末端限制性片段分析技術，其原理見圖2，基于限制性內切酶的特異性——只在識別位點切割雙鏈DNA，因此具有高度的序列特異性和較高的分辨率、精確度和靈敏度等特點，且能夠迅速獲得大量數據，準確、快速、真實地反映微生物的多樣性。

圖2 末端限制性長度多態性原理圖Fig.2 Schematic diagram of terminal restricted length polymorphism

T-RFLP 技術近年來被廣泛應用于環境微生物群落多樣性的分析中。López 等在區分蜂蜜和其他蜂源中80 個菌株的過程中，證實RFLP 方法簡單易行，能用于蜂蜜樣品中菌種的預篩選和分離鑒定。Rosa 等分別使用API 20 Strep（鏈球菌鑒定系統）、PCR-RFLP 和MALDI-TOF-MS（基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜）分析了從綿羊和山羊奶樣品中收集的195 種鏈球菌分離株，結果顯示PCR-RFLP 是鑒定牛奶樣品中鏈球菌最準確的方法。雖然T-RFLP具有存在不同菌種DNA 的差異性擴增、菌種間目標DNA 拷貝數存在差異、復雜群落多樣性被低估等缺點，但在使用T-RFLP 法進行分析時，充分考慮研究目的、環境條件和樣品特征，便會使分析結果準確可靠，因此T-RFLP 技術在操作性和準確性方面與其他技術相比具有一定的優勢。

3 熒光標記法

熒光標記法是利用熒光蛋白或熒光蛋白基因作為標志物對研究對象進行標記的分析方法，該方法所依賴的化合物稱為熒光物質，利用熒光檢測裝置定位熒光所在位置或分析熒光強弱來達到實驗目的。

3.1 熒光原位雜交技術（FISH）

熒光原位雜交技術（FISH）是一種在細胞環境中對核酸進行空間檢測和定量的技術。原理見圖3，用熒光素標記的核酸探針與待測樣本的核酸序列按堿基互補配對原則進行雜交，最終可以用熒光顯微鏡觀察到基因所在位置。作為一種非放射性的檢測系統，因其具有經濟、安全且探針穩定，實驗周期短、特異性好、定位準確且可定位1 kb 長度的DNA 等優點，現已成為用于細胞和組織上轉錄分析的強大細胞遺傳學分析方法，但由于細胞內靶定分子數量較少，且探針在細胞內的滲透性差，雜交效率低等因素，導致檢測靈敏度不高，同時可能會產生假陰性或假陽性，適當的使用陰性和陽性對照以及開發可靠的測定方案是解決問題的關鍵。

圖3 熒光原位雜交原理圖Fig.3 Schematic diagram of fluorescence in situ hybridization

熒光原位雜交技術可應用于醫學、環境學、微生物學等各大領域。Zhang 等利用基于分子信標的熒光雜交（MB-FISH）用于快速直接檢測金黃色葡萄球菌，結果顯示MB-FISH 具有很強的特異性和高靈敏度，可用于在陽性血液培養物中直接檢測金黃色葡萄球菌。Salimi 等在溫度、探針、鹽和甲酰胺濃度等參數上優化FISH 效率的過程中，證實FISH 是一種快速且準確地檢測切碎的羔羊沙門氏菌的可靠方法。Baliga 等發現應用于培養的MN Genus-MTBC 雙探針熒光FISH 分析也可用于資源有限的結核病流行國家，以快速鑒定和區分痰液樣本中的MTBC（結核分枝桿菌復合體）和NTM（非結核分枝桿菌）。熒光原位雜交雖然在技術上存在一定的缺陷，但可以通過優化溫度、探針、熒光素顏色以及DNA 濃縮程度等條件，提高熒光原位雜交的分辨率，使其可以快速準確地檢測待測樣本。

3.2 實時熒光定量PCR 技術（RT-qPCR）

實時熒光定量PCR 技術分為染料法和探針法，其原理見圖4，在PCR 反應中加入熒光基團，通過連續監測熒光信號出現的先后順序以及信號強弱的變化，即時反映出目的基因的初始量。該方法適用于任何DNA，并且不必設計復雜的探針，同時具有非常靈敏且便宜的優點，雖極易與非特異性雙鏈DNA 結合，產生假陽性，但具體研究中可以通過熔解曲線的分析，優化反應條件來解決假陽性問題。

圖4 實時熒光定量PCR 原理圖Fig.4 Principle diagram of real-time fluorescence quantitative PCR

實時熒光定量PCR 分為絕對定量和相對定量，分別可應用于病原體檢測、轉基因食品檢測、基因表達研究、高通量基因檢測方法的驗證、藥物療效考核和耐藥性研究等方面。Bahlinger 等建立了兩種多重qPCR 方法來檢測肉類和熱處理肉制品中假單胞菌、腸桿菌科、熱鏈絲菌和葡萄球菌的含量，有助于篩查涉嫌食品欺詐的食品。Pancza 等使用qPCR法對牛奶中的致病菌和腐敗菌進行了檢測，驗證了該方法的可行性。Brotons 等利用RT-qPCR 檢測巴塞羅那地區2709 名無癥狀青少年和成年人的唾液樣本，僅有0.6%的檢測結果無效，證實RT-qPCR 是一種可以簡單、快速且準確地檢測無癥狀患者是否感染新型冠狀病毒，并有望在社區擴大篩查中推廣應用。RT-qPCR 因其具有快速且準確的特點，受到廣大研究者的青睞，但該方法由于過度依賴于DNA 提取技術和PCR 技術，DNA 提取效率和PCR 技術的缺陷必會影響檢測結果的真實性，因此需要不斷改進DNA 提取技術與PCR 技術，例如改進DNA 的提取效率以及引物的特異性等，以此來增強RT-qPCR技術檢測結果的可靠性。

4 高通量測序

高通量測序技術（High-throughput sequencing，HTS）又稱為新一代測序技術（next generation sequencing，NGS），現已由第一代測序技術衍化到第三代測序技術，包括擴增子測序（amplicon sequencing）、宏基因組測序（metagenomics sequencing）、轉錄組測序（transcriptome sequencing）等。高通量測序技術的實驗流程見圖5。高通量測序技術已被廣泛地應用于環境微生物分子生態學研究中，但高通量測序技術需要依靠測序儀對整個微生物組的基因信息進行檢測，導致其檢測成本相對較高，同時對于16S rRNA測序來說，需要對樣本進行PCR 擴增，將會使結果產生一定的誤差，對于宏基因組測序和宏轉錄組測序來說，需要具備雄厚的生物信息學知識，且最終只能得出微生物群落的相對豐度，并不能得出具體的數量。

圖5 高通量測序流程圖Fig.5 Flow chart of high-throughput sequencing

4.1 擴增子測序技術

擴增子測序技術是一種基于PCR 擴增微生物種群基因組特定區域并通過高通量測序研究樣本中微生物組成及功能的方法。因其具有快速、簡單、廉價的優點，被廣泛應用于鑒定細菌和古菌的16S rRNA 基因、真核生物的18S rRNA 基因以及真菌的ITS 區域當中。由于目前使用通用引物和二代測序平臺，會使測序結果產生較大誤差，導致生物功能信息的獲取具有一定的局限性。因此，結合其他微生物分子生態學研究方法來解決所獲得生物功能信息受限的問題迫在眉睫。

擴增子測序技術，即先從樣本中提取完整的DNA，隨后利用通用引物擴增該“特定區域”基因并完成建庫測序。周天慈等利用高通量擴增子測序技術對中高溫大曲中微生物的來源進行了分析，為優化制曲工藝，提升白酒品質提供理論支撐。Zhao 等利用16S rRNA 擴增子測序分析了四川工業泡菜的細菌譜，發現了四川工業泡菜中的優勢菌和產香菌。Kamimura 等利用16S rRNA 擴增子測序分析了手工奶酪中的細菌多樣性，顯示發酵劑在微生物群塑造方面具有很強的相關性。擴增子測序技術在剖析微生物群落方面具有快速且成本較低的優點，但由于PCR 擴增和引物親和力的差異導致檢測結果產生偏差，同時分辨率較低，僅區分到屬級。與之相比，宏基因組在物種層面上進行鑒定，能夠研究目前存在的微生物的功能潛力，并可能揭示未知物種。

4.2 宏基因組

宏基因組即環境中全部微生物基因的總和。它主要針對環境樣品中微生物群落的遺傳物質進行研究，可充分發掘未培養和未鑒定微生物的基因多樣性與生化反應。

近年來，以高通量測序為基礎的宏基因組學現已被廣泛應用于酒曲等其他食品微生物組研究中，為認識和篩選功能微生物提供了重要指導。王正等采用多組學聯用技術探究了谷物蛋白對白酒發酵過程中微生物群落及其代謝多樣性的影響，為提高白酒發酵的可控性及質量提供了依據。Wang 等利用高通量測序解析了酒曲中功能微生物菌群的組成情況。Lu 等基于功能基因組學的分析，揭示了中國茅臺風味酵母MT1 的潛在特征。課題組前期對來自重慶仙女山草原的黃牛糞便樣品進行宏基因組測序，并通過比對和篩選得到7 個公認的木聚糖異構酶基因，在大腸桿菌和釀酒酵母中進行異源表達證明了其酶活力。

宏基因組學技術相對于傳統培養和分子指紋圖譜在獲得數據量和可操作性方面有了很大進步，但仍不夠完善，尚存在著諸多的問題：現有的算法無法完全利用龐大的測序數據而造成的浪費；DNA 經剪切后再拼接難以控制完整片段的閾值而造成的誤差等。目前，研究人員發現“淺宏基因組”可以完美解決這一問題，該方法測序深度相對較低，但物種分辨率并沒有低于一般宏基因組，而且具有更高的性價比。

4.3 宏轉錄組

轉錄組學是指一門在整體水平上研究細胞中基因的表達情況及轉錄調控規律的學科，目前主要存在三種轉錄組處理技術：RT-PCR、微陣列和下一代RNA 測序。

隨著測序技術的發展，宏轉錄組學的方法在環境微生物的研究中被廣泛應用，包括土壤、湖泊和海洋等生態系統。Bei 等通過宏基因組和宏轉錄組闡明了意大利改良稻田中的遺傳潛力和功能活性。Mojib 等使用原位宏轉錄組學方法揭示了紅海中代謝活躍的中型浮游動物群落的功能基因組組成。Rippin 等分別使用宏轉錄組和形態學鑒定生物土壤結皮中群落結構，顯示出宏轉錄組高豐富度的優點。這些研究表明，與單一方法相比，多種技術的結合才能揭示復雜群落的更高屬豐富度。

如果說宏基因組可以表明微生物群“能做什么”，那么宏轉錄組則可以說明微生物“想做什么”。但是，宏轉錄組學與宏基因組學一樣，需要依賴于測序技術和生物信息學分析，那么勢必會導致以下結果：基因組大小出現“縮水”現象；浪費部分測序的數據；宏轉錄組測序數據量較大，且不同的算法可能結果差異甚大；對低豐度基因的檢測較困難；費用較高，并使結果的可靠性和再現性降低。

5 功能基因組

功能基因組學常見的分析方法有基因芯片和RNA 測序等技術，又稱為后基因組學，是指基于基因組序列信息，利用各種組學技術，在系統水平上將基因組序列與基因功能（包括基因網絡）以及表型有機聯系起來，最終揭示自然界中生物系統不同水平的功能的科學。

5.1 基因芯片

近年來，基因芯片的發展及其在環境DNA 雜交分析中的應用，極大地促進了對環境微生物種群多樣性和活性的分析。在這種方法中，樣本DNA 通常是在基于PCR 擴增之后，熒光標記并與基因芯片接觸。在基因芯片上，多達數以萬計的核苷酸探針，無論是由16S rRNA 基因片段或功能基因片段組成，都被置于一個密集陣列中。樣本中與芯片上的探針同源的基因，將會通過基因組雜交來獲得其同源對應基因的位置。經過雜交，芯片上的信號被數字化分析。這樣可以在高通量下獲得系統發育多樣性和群落組成以及功能位置的信息。

基因芯片適用于不同環境樣本群落組成及功能的分析，Taguchi 等開發了一種不需要對目標核酸片段進行熒光標記、擴增或洗滌的新型基因芯片系統，與傳統的依賴PCR 的基因芯片相比，速度明顯更快。Shin 等使用基因芯片和BacT/Alert 培養系統分別檢測含抗生素樣品中的大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌，基因芯片在抗菌治療后約4～24 h 獲得真陽性結果，其中基于培養的方法未能檢測到病原菌，證實基因芯片可用于有效檢測適當使用抗生素患者臨床樣本中的病原菌。Sohrabi 等使用基因芯片和組織學來檢查肉類的成分和安全性，提高牛肉行業的監測能力。目前基因芯片存在探針設計困難和相似基因互相雜交等一系列問題，因此探針開發、雜交質量和數據評價是合理應用DNA 微陣列研究環境微生物區系的關鍵步驟。

5.2 RNA 測序

RNA 測序即轉錄組測序技術，就是用高通量測序技術進行測序分析，反映出mRNA、smallRNA、noncodingRNA 等或者其中一部分的表達水平。

在過去的二十年中，RNA 測序二技術迅速發展，并成為了在轉錄組水平上分析差異基因表達或mRNA可變剪切的不可缺少的工具。Tan 等開發了一種通過標準RNA 測序識別RNA 修飾的ModTect 統計框架，表明轉錄組失調與癌癥進展和生存結果相關，可用于發現患者RNA 修飾與臨床結果之間的關聯。Kim 等對35 個果園的梨樹葉片樣本進行了RNA 測序，基于轉錄組數據構建了三個完整的基因組，并進行了系統發育分析，確定蘋果莖溝病毒（ASGV）和蘋果莖凹坑病毒（ASPV）為韓國主要梨品種“Singo”的優勢病毒。目前，RNA 測序可以在單細胞水平上對細胞群進行特異性分析，揭示每種細胞類型的獨特變化，但RNA 測序對低豐度轉錄本的檢測性能有待提高，可通過技術改進和優化分析方法解決。

6 展望

微生物在全球尺度上調控著生物地球化學循環過程，影響生態系統的功能。理解生態系統功能，從群落和單細胞水平揭示自然環境中微生物的種類和功能、微生物之間以及微生物與環境因子之間的相互作用是必不可少的。

分子生物學方法的發展和進步為環境微生物的研究提供了方便，但是不同方法各有其內在的局限性，在方法的應用上需根據研究具體情況進行選擇。例如，DGGE、T-RFLP、FISH、RT-qPCR、高通量測序和宏組學等研究方法均是近些年快速發展的方法，與純培養法、Biolog 微平板法和PLFA 圖譜分析等傳統方法相比，微生物多樣性分析的廣度、深度和分辨率均有顯著提高，顯示出了其前所未有的優勢和應用前景。

然而，這些方法本身仍存在一些問題：

a.基于DNA 序列的方法，由于不能區分活細胞和死細胞，可能會導致假陽性結果，如RT-qPCR在擴增過程中，以死細胞或損傷細胞的 DNA 作為PCR 模板，將會增大檢測結果，為克服這一缺陷，有研究發現脫氧膽酸鈉（SD）和單疊丙酸丙啶（PMA）與 RT-PCR 技術相結合，可有效消除死亡細胞和損傷細胞對PCR 擴增的影響。

b.基于PCR 的方法，由于引物的選擇以及 PCR本身的問題易對微生物的理解帶來偏差，可利用Bellerophon、Uchime等軟件并通過生物信息學分析移除假序列。

c.高通量測序得到的多為幾百個堿基或者更短的序列，組成完整的基因有一定困難；即使獲得整條序列，由于很多基因的功能還不清楚，很難獲得由序列到功能的準確圖譜。

未來的工作中，宏組學和單細胞水平研究的方法將有助于揭示自然環境中微生物整個群落的分類、功能信息以及豐度較低但發揮重要功能作用的微生物種群，然而，這并不代表著傳統方法的研究應被終止，因為宏組學方法的研究依賴于培養技術所產生的參考數據庫。同時，單細胞水平研究方法中的拉曼光譜-熒光原位雜交和納米二次離子質譜-熒光原位雜交為環境中微生物的單細胞生態學和代謝潛力的研究開辟了一個新的途徑。隨著測序技術和單細胞水平研究技術等微生物分子生物學方法的不斷改進及數據分析工具的不斷發展，對環境中微生物群落組成、微生物之間的相互作用的認識以及對生態系統的功能的理解也在不斷加深，對進一步深入了解微生物群落乃至微生態系統具有重要意義。