高效液相色譜指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法評(píng)價(jià)瑤藥材網(wǎng)絡(luò)雞血藤根的質(zhì)量

嚴(yán)赟，郭雯雯，林小娟，張赟赟，楊海船，王彩玉，黃莉（.廣西中醫(yī)藥研究院，南寧 500；.廣西食品藥品檢驗(yàn)所，南寧 500；.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 54004）

網(wǎng)絡(luò)雞血藤根是豆科植物網(wǎng)絡(luò)崖豆藤M(fèi)illettia reticulataBenth.的干燥根，瑤族習(xí)用藥材。《全國中草藥匯編》《中國民族藥志要》《中國瑤藥學(xué)》《廣西藥用植物名錄》等對(duì)其原植物、藥用價(jià)值、地理分布等情況均有簡要記述，其具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò)、強(qiáng)筋骨、鎮(zhèn)靜的功效，用于治療風(fēng)濕筋骨痛、四肢麻木、腰膝酸痛、癱瘓、貧血、遺精、盜汗、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、跌打損傷等病癥，為多民族使用的民間草藥[1-4]。目前尚無國家標(biāo)準(zhǔn)及地方標(biāo)準(zhǔn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材進(jìn)行質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)，近年來，廣西打造特色健康醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，鼓勵(lì)壯瑤藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展壯大，因此有必要全面地評(píng)價(jià)網(wǎng)絡(luò)雞血藤根的化學(xué)成分，建立能有效、全面控制該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。中藥成分復(fù)雜，利用中藥指紋圖譜中的相似度分析評(píng)定各批次樣品指紋圖譜間的相似程度，描述它們各自化學(xué)組分的差異性和波動(dòng)情況，能更全面地反映出藥材的質(zhì)量[5-8]。主成分分析是近年來中藥指紋圖譜結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法形成的一種方法研究。中藥為多成分物質(zhì)且很多成分均未有研究報(bào)道，主成分分析是為了預(yù)測(cè)該中藥可能的主要作用成分，對(duì)于該中藥進(jìn)行后期的物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立以及藥效藥理等方面的研究具有指導(dǎo)意義[9-12]。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材進(jìn)行分析，建立HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，并結(jié)合聚類分析和主成分分析，為不同產(chǎn)地的網(wǎng)絡(luò)雞血藤根質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)和參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters2695-2998高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Milli-Q超純水儀（德國默克）；XS205DU型電子天平（十萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司）；S120H超聲儀（德國艾爾瑪）。

1.2 材料

對(duì)照品芒柄花素（批號(hào)：111703-200501，供鑒別用，中國食品藥品檢定研究院，經(jīng)HPLC峰面積歸一化法檢測(cè)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.12%）；乙腈、磷酸、甲醇、三氯甲烷均為色譜純，其他化學(xué)試劑為分析純，水為超純水；10批廣西不同產(chǎn)地網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材（見表1），經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為豆科植物網(wǎng)絡(luò)崖豆藤的干燥根。

表1 網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材來源信息表Tab 1 Source of Millettia reticulata radix

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Purospher STAR RP-18 endcapped（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）和0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2），流速1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長249 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.2 供試品溶液的制備

稱取網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材粉末（過2號(hào)篩）約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液50 mL超聲提取（功率：200 W，頻率：37 kHz）30 min，過濾，藥渣用30 mL三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液洗滌3次，每次10 mL，合并濾液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙舛ㄈ莸? mL量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取芒柄花素對(duì)照品15.74 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解定容作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL置20 mL的量瓶中，加甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為23.61 μg·mL－1的對(duì)照品溶液。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批（S1）網(wǎng)絡(luò)雞血藤根樣品，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜，以4號(hào)峰為參照物峰，結(jié)果各共有峰相對(duì)峰面積的RSD為0.14%～4.9%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.091%～1.8%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（S1）網(wǎng)絡(luò)雞血藤根樣品，按照“2.2”項(xiàng)下條件平行制備6份，進(jìn)樣測(cè)定，記錄指紋圖譜，以4號(hào)峰為參照物峰，結(jié)果各共有峰相對(duì)峰面積的RSD為2.2%～4.9%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.10%～0.13%，表明該方法重復(fù)性好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批（S1）網(wǎng)絡(luò)雞血藤根樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，分別在0、1.5、3、6、12、24 h，進(jìn)樣測(cè)定，以4號(hào)峰為參照物峰，結(jié)果各共有峰相對(duì)峰面積的RSD為0.18%～4.3%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.060%～0.24%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立

分別取10批不同產(chǎn)地網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行全譜匹配，以S1號(hào)色譜圖為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法生成共有模式R，共確定了17個(gè)共有色譜峰（見圖1）。經(jīng)過與對(duì)照品圖譜對(duì)比，指認(rèn)13號(hào)峰為芒柄花素（見圖2），4號(hào)峰峰面積較大，且分離度符合要求，故設(shè)為參照物峰，計(jì)算得到10批圖譜中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于1.1%，表明各共有色譜峰保留時(shí)間穩(wěn)定，但相對(duì)峰面積的RSD值為53.9%～146.4%（見表3），差異較大。說明10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材在化學(xué)成分種類上具有一致性，但各批次同一成分的含量差異明顯。

圖1 10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材HPLC指紋圖譜重疊圖Fig 1 Overlapping map of the HPLC fingerprints of 10 batches of Millettia reticulata radix

圖2 芒柄花素對(duì)照品Fig 2 Formononetin reference substance

3 數(shù)據(jù)分析

3.1 指紋圖譜相似度分析

采用國家藥典委員會(huì)《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版），計(jì)算10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材的相似度，以S1號(hào)色譜圖為參照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行色譜峰匹配，中位數(shù)法生成共有模式（R），結(jié)果各批藥材的相似度值在0.801～0.951（見表4），說明各產(chǎn)地的藥材有較好的一致性，本研究建立的指紋圖譜可以用于網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材的質(zhì)量控制。

表4 10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材相似度分析結(jié)果Tab 4 Similarity analysis of 10 batches of Millettia reticulata radix

3.2 聚類分析

以網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材HPLC指紋圖譜的17個(gè)共有峰的峰面積為特征，得到 17×10階原始數(shù)據(jù)矩陣，運(yùn)用 SPSS 23.0 分析軟件對(duì)其進(jìn)行聚類分析，采用組間連接法，以歐式平方距離為測(cè)度，Z標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3。當(dāng)分類距離為10時(shí)，10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材可以聚為三大類，其中S1、S4、S6、S7、S8、S9、S10 聚為第Ⅰ類；S2、S3聚為第Ⅱ類；S5單獨(dú)聚為第Ⅲ類。

圖3 10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材聚類分析圖Fig 3 Cluster analysis diagram of 10 batches of Millettia reticulata radix

3.3 網(wǎng)絡(luò)雞血藤根指紋圖譜的主成分分析

主成分分析運(yùn)用數(shù)學(xué)中的降維思想，在基本保留原始指標(biāo)信息的前提下，以互不相關(guān)的綜合指標(biāo)來反映原始指標(biāo)所提供的信息。將10批樣品的17個(gè)共有峰的峰面積作為變量，通過SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)Z標(biāo)準(zhǔn)化處理，并作為新變量進(jìn)行主成分分析。計(jì)算主成分的特征值及方差貢獻(xiàn)率見表5。從表5可以看出，網(wǎng)絡(luò)雞血藤根主成分分析中成分1、2、3、4 主成分的特征值均＞1，累積方差貢獻(xiàn)率87.219%。進(jìn)一步分析主成分載荷矩陣，主成分載荷矩陣反映了各變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)大小和作用方向，載荷的絕對(duì)值越大，對(duì)主成分的貢獻(xiàn)越大，見表6，從表6可以看出，主成分1 的信息來自色譜峰1、3、6、13、16，其中13號(hào)峰為芒柄花素，主成分2 的信息來自色譜峰9、12、14，主成分3 的信息來自色譜峰8、10，主成分4 的信息來自色譜峰4、15。

表5 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Tab 5 Principal component eigen values and variance contribution rate

表6 主成分載荷矩陣Tab 6 Principal component loading matrix

4 討論

本研究對(duì)10批不同產(chǎn)地網(wǎng)絡(luò)雞血藤根的HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度分析、聚類分析和主成分分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材之間相似度均大于0.8，說明藥材中化學(xué)成分相似度較高，各產(chǎn)地的藥材有較好的一致性。但是不同產(chǎn)地藥材各共有峰含量差異較大，通過對(duì)10批藥材指紋圖譜以及17個(gè)共有峰峰面積的比較，發(fā)現(xiàn)相似度低于0.9的4批藥材呈現(xiàn)兩個(gè)極端，S4、S7、S9指紋圖譜各峰含量相比其他批次都較小，17個(gè)共有峰峰面積總和排名最后三位，S5指紋圖譜各峰含量是10批藥材中最高的，17個(gè)共有峰峰面積總和排名第一，是排名最后的S7總峰面積的5倍多，證明了藥材的生長環(huán)境對(duì)藥材有效成分的含量影響非常大，這對(duì)我們后期規(guī)范種植選址具有重要的參考意義。

采用SPSS 23.0分析軟件系統(tǒng)聚類發(fā)現(xiàn)，可聚為三大類，其中S1、S4、S6、S7、S8、S9、S10 聚為第Ⅰ類；S2、S3聚為第Ⅱ類；S5單獨(dú)聚為第Ⅲ類。由圖3可以看出S5被單獨(dú)聚為一類，S4、S7、S9在第Ⅰ類中被單獨(dú)聚為一小類，與相似度分析的結(jié)果基本一致。

采用SPSS 23.0分析軟件進(jìn)行主成分分析，確定 4個(gè)主成分，其方差貢獻(xiàn)率依次為39.421%、23.888%、15.202%、8.708%，累積方差貢獻(xiàn)率為87.219%，代表了網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材80%以上的信息。進(jìn)一步分析主成分載荷矩陣，考察各峰對(duì)主成分的貢獻(xiàn)大小。結(jié)果表明色譜峰1、3、6、13、16，對(duì)主成分1的貢獻(xiàn)率較大，可作為網(wǎng)絡(luò)雞血藤根質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)成分，其中13號(hào)峰為芒柄花素，為后期含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)和參考。

傳統(tǒng)瑤藥由于成分復(fù)雜，需要利用現(xiàn)代色譜技術(shù)對(duì)盡可能多的化學(xué)成分進(jìn)行表征。本試驗(yàn)建立了不同產(chǎn)地網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材 HPLC 指紋圖譜，對(duì)其中1個(gè)共有峰進(jìn)行了化學(xué)成分指認(rèn)，初步反映了網(wǎng)絡(luò)雞血藤根整體化學(xué)特征，同時(shí)結(jié)合聚類分析和主成分分析多方面評(píng)價(jià)網(wǎng)絡(luò)雞血藤根質(zhì)量，為其整體質(zhì)量控制提供了依據(jù)。