黑龍江省馬鈴薯黑痣病菌融合群類型分析

楊帥，郭梅*，王文重，魏琪，董學志，毛彥芝，閔凡祥，王玲

（1.黑龍江省農業科學院經濟作物研究所，黑龍江哈爾濱150086；2.黑龍江省農業科學院耕作栽培研究所，黑龍江哈爾濱150086）

立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKühn）是一種在全球范圍內均有分布的土壤習居菌，其侵染寄主廣泛、腐生能力強且土壤中存活時間長，被認為是最具破壞性的土傳病原之一。該病原菌最早由法國人Kühn于1858年[1]發現，此后美國、澳大利亞、南非等國也分別進行了報道。在中國最早的報道是在20世紀初期，但因當時危害并不嚴重而未引起人們的關注[2]。在立枯絲核菌的研究方面，因其種內和種間存在著豐富的遺傳多樣性而被認定為是一個遺傳差異較大的復合種。此后，以Schultz[3]提出的菌絲融合概念和Parmeter等[4]提出的種內融合群分類法為基礎，日本學者生越明[5]建立的融合群分類法成為國際公認的分類標準。隨著國內外學者研究的深入，目前國際公認的已知融合群類型已有14種，分別被命名為AG-1～AG-13及AG-BI[6,7]。此外，根據融合群內的融合頻率、寄主范圍、培養性狀、致病性及生化和遺傳特性等差異，一些融合群還可以進一步被劃分為不同的亞群。如根據寄主的不同，AG-3融合群還被分為AG-3PT（馬鈴薯型）、AG-3TB（煙草型）和AG-3TM（番茄型）[8]；而根據致病性，AG-1可以被分為IA、IB和IC三個亞群。

馬鈴薯是中國的第四大糧食作物，具有耐旱、耐貧瘠、廣適性強等優點。由立枯絲核菌引起的馬鈴薯潰瘍病和黑痣病是馬鈴薯生產上極具威脅的一種土傳病害[9,10]。該病能在馬鈴薯生育期持續造成危害，如苗期危害幼芽引起生長點壞死從而導致氣生塊莖的產生；危害地下莖基部形成褐色梭型條斑導致地上部植株出現萎蔫等癥狀。同時其菌絲在薯塊表皮還可以形成黑色菌核，造成馬鈴薯塊莖表面出現裂口、粗皮、黑痣等癥狀，嚴重影響了種薯的品質和商品性，進而造成巨大經濟損失[11]。

黑龍江省地處中國東北部，不僅地理位置優越而且兼具得天獨厚的冷涼氣候，是中國重要的馬鈴薯種薯及商品薯主產區之一[12]。然而，近年來隨著馬鈴薯產業的快速發展，由于缺乏輪作、種薯調運不當等原因，造成黑龍江省馬鈴薯黑痣病發生日趨嚴重，一般年份可達10%～30%，重癥地塊發病率高達70%～80%，嚴重影響了馬鈴薯的產量和品質[13]。本研究采用分子生物學方法，系統分析了近十年來黑龍江省馬鈴薯主產區黑痣病菌融合群類型變化情況，以期更好地了解黑龍江省黑痣病菌融合群組成、分布及變化動態，進而為制定科學、精準的黑痣病防治策略提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試馬鈴薯黑痣病樣品分別于2012～2021年采自黑龍江省10個馬鈴薯主產區的21個馬鈴薯種植區，具體見圖1。田間采集樣品經常規組織分離法[14]分離后，獲得純化立枯絲核菌菌株，經PDA平板活化后，移入試管PDA斜面，4℃保存、備用。

圖1 黑龍江省馬鈴薯黑痣病樣品地理分布Figure 1 Geographical distribution of potato black scurf samples in Heilongjiang Province

1.2 菌株基因組DNA的提取

黑痣病菌經分離、純化后，采用商業化基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。提取DNA后利用微量分光光度計檢測DNA純度，取OD260/OD280比值在1.8～2.0的DNA用于后續PCR擴增試驗。

1.3 融合群類型測定

根據White等[15]報道的ITS序列分析法進行融合群測定。采用通用引物（ITS4和ITS5）對菌株樣品的ITS1-5.8S-ITS2區段進行擴增，同時利用特異性引物AG-2-1-F/R和Rs1F2/AG-3PR2對AG-2-1和AG-3PT進行輔助驗證[16,17]，引物見表1。PCR反應條件及體系按照康為世紀生物科技有限公司的2xEs Taq MasterMix產品說明書進行。擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳后，利用凝膠成像儀在紫外光下檢測并拍照。

表1 融合群測定引物Table 1 Primers for detection of anastomosis group

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯黑痣病菌樣品采集及分離

2012～2021年在黑龍江省哈爾濱、齊齊哈爾、綏化、牡丹江、雙鴨山、佳木斯、伊春、鶴崗、黑河和大興安嶺10個馬鈴薯主產區共采集分離了482份馬鈴薯黑痣病菌菌株樣品，具體信息如表2所示。

表2 2012～2021年黑龍江省黑痣病菌樣品采集信息Table 2 Information of potato black scurf isolates collected from 2012 to 2021 in Heilongjiang Province

2.2 黑龍江省馬鈴薯主產區致病菌融合群類型鑒定

對采自黑龍江省10個主產區的482份致病立枯絲核菌樣品完成分離純化后，采用商業化基因組DNA提取試劑盒提取每個樣品的總DNA，并進行純度檢測。微量分光光度計檢測結果表明，所提DNA樣品的OD260/OD280比值均介于1.8～2.0。電泳結果如圖2所示，均為單一條帶，可以用于后續試驗。

圖2 黑龍江省馬鈴薯黑痣病樣品基因組DNA檢測電泳圖（部分樣品）Figure 2 gDNA extracted from potato black scurf isolates in Heilongjiang Province(partial samples)

利用ITS區通用引物進行融合群鑒定，經PCR擴增后獲得約700 bp的ITS1-5.8S-ITS2區域目的片段，部分樣品電泳見圖3。經BLAST序列比對后，482份菌株隸屬5個融合群，其中，344個菌株屬于AG-3，出現頻率為71.37%；70個菌株屬于AG-5，出現頻率為14.52%；32個菌株屬于AG-2，出現頻率為6.64%；34個菌株屬于AG-4，出現頻率為7.05%；2個菌株屬于AG-1，出現頻率為0.42%；無其他融合群出現（表3）。其中，AG-2融合群中包括AG-2-1、AG-2-2IIIB和AG-2-2IV三個融合亞群，出現頻率分別為50.00%、6.25%和43.75%；AG-4融合群中只鑒定到AG-4-HGI和AG-4-HGII兩個融合亞群類型，出現頻率分別為70.59%和29.41%，未有AG-4-HGIII出現（表4）。同時，AG-2-1和AG-3PT經特異性引物AG-2-1-F/R和Rs1F2/AG-3PR2進行輔助驗證，PCR擴增分別可以獲得480和474 bp陽性目的片段（圖4）。

表3 黑龍江省馬鈴薯立枯絲核菌融合群類型及分布Table 3 Anastomosis group and distribution of R.solani isolates collected in Heilongjiang Province

表4 馬鈴薯立枯絲核菌AG-2和AG-4融合亞群的鑒定及分布Table 4 Anastomosis subgroup and distribution of R.solani AG-2 and AG-4

圖3 ITS引物擴增PCR產物凝膠電泳圖（部分樣品）Figure 3 Agarose gel electrophoresis of PCR products amplified by ITS primers(partial samples)

圖4 AG-2-1和AG-3PT特異性引物檢測電泳圖Figure 4 Agarose gel electrophoresis of AG-2-1和AG-3PT amplified by specific primers

從黑龍江省馬鈴薯種植區域分布來看，在全省10個馬鈴薯主產區AG-3融合群均有發生，且所占比例均很高，因此，AG-3是馬鈴薯致病立枯絲核菌的優勢融合群。從致病融合群的豐富度來看，哈爾濱、齊齊哈爾、綏化3個地區的融合群類型較為豐富，除了AG-3外，還有AG-1、AG-2、AG-4和AG-5多種融合群，說明黑龍江省西部地區的馬鈴薯黑痣病菌群體遺傳多樣性較為復雜。與之相對比，黑龍江省東部地區融合群類型相對單一，其中牡丹江和黑河地區均有少量AG-5融合群發生，佳木斯和鶴崗則偶有AG-2融合群出現，其他地區僅有AG-3融合群（圖5）。

圖5 黑龍江省馬鈴薯主產區黑痣病菌融合群類型組成及分布Figure 5 Type and distribution of anastomosis group of black scurf isolates collected in main potato growing regions of Heilongjiang Province

3 討論

鑒于立枯絲核菌種內及種間遺傳多樣性豐富，因此該菌常被界定為一個遺傳差異較大的復合種[17]。自1936年Schultz[3]首次提出立枯絲核菌菌絲融合群的概念后，由日本學者生越明[5]建立了得到國際公認的融合群鑒定方法。傳統的菌絲融合群是將2個待測菌株進行對峙培養后，利用光學顯微鏡觀察菌絲的生長和交疊現象。由于菌絲融合法只能劃分不同融合群，但不能很好的反映其種內及種間的變異關系，因此隨著分子生物學的發展，能夠在分子水平上反映遺傳變化的rDNA-ITS序列分析法，成為研究立枯絲核菌遺傳多樣性的重要手段。

馬鈴薯黑痣病是馬鈴薯生產上最具威脅的土傳病害之一。國內外研究均表明AG-3融合群是引起馬鈴薯黑痣病的優勢融合群類型[18]。黑龍江省作為中國東北部主要的種薯和商品薯生產基地，近年來馬鈴薯黑痣病的發生呈逐年增加且日趨嚴重的趨勢，田間發病率在大發生年份可達70%以上。關于黑龍江省馬鈴薯黑痣病融合群的相關研究起步較晚，其中田曉燕等[19]、李曉妮等[20]雖然均有關于黑龍江省黑痣病菌融合群類型的報道，但由于樣品數量和采集地點相對較少，因此并不能很好的反映出黑龍江省的病原特點。本研究系統梳理了10年來黑龍江省馬鈴薯黑痣病菌的融合群類型組成及分布情況，綜合樣品數量、出現頻率以及地域分布情況，不僅充分說明了AG-3依然是黑龍江省馬鈴薯主產區優勢致病融合群類型，也清晰的反映出AG-5融合群已經和AG-4融合群一樣成為了危害黑龍江省馬鈴薯的次優勢菌群。同時，本次調查還發現了AG-1-IB、AG-2-2IIIB、AG-2-2IV三個融合亞群，這也是分別在黑龍江省的首次發現。此外，在AG-4融合群中僅鑒定出AG-4-HGI和AG-4-HGII兩個融合亞群，未獲得AG-4-HGIII，這一結果與李曉妮等[20]的研究結果相一致，但Yang等[21]在黑龍江省39份樣品中分離出AG-4-HGIII，說明黑龍江省馬鈴薯黑痣病菌融合群類型較為復雜，融合群的豐富度與樣品的來源密切相關。牟明等[22]對黑龍江省馬鈴薯黑痣病融合群的鑒定中，發現了AG-1-IA、AG-1-IC、AG-6、AG-8四個融合群類型，也再次證明對不同區域馬鈴薯黑痣病菌融合群類型的監測十分必要。