肥胖降低乙型肝炎患者干擾素治療敏感性的機制研究*

張炳楊，逯素梅，馬萬山，3△

1.山東大學，山東濟南 250010；2.山東省千佛山醫院檢驗科，山東濟南 250014；3.山東第一醫科大學第一附屬醫院檢驗科，山東濟南 250014

乙型肝炎(以下簡稱乙肝)流行范圍廣，嚴重危害國人健康。在發展中國家，乙型肝炎病毒(HBV)被認為是導致肝硬化的主要原因[1]。采用干擾素(IFN)治療乙肝方法經典，但是治療效果個體差異大[2]。臨床工作中發現，肥胖體質的乙肝患者對IFN治療敏感性下降，深入研究其原因及機制意義重大。研究表明，肥胖體質加劇了乙肝肝硬化的進展[3-4]。肝臟常駐細胞(如庫普弗細胞等)和因損傷而被招募的細胞(如單核-巨噬細胞)都會發出促炎癥信號，包括(但不限于)細胞因子、趨化因子、脂質信使和活性氧，可促使肝細胞的凋亡或壞死[5-7]。同時，垂死的肝細胞釋放出損傷相關的分子模式，與進化保守的模式識別受體結合后，激活先天免疫系統細胞，進一步刺激炎癥反應，建立一個高度肝臟毒性的炎癥和細胞死亡的前饋循環[8-9]。乙型肝炎病毒蛋白X(HBX)是HBV的一種調節蛋白，它激活Stat1，導致產生Ⅰ型IFN，表達HBX的肝細胞分泌的Ⅰ型IFN通過與同源的Ⅰ型IFN受體結合增強抗病毒信號[10-11]。慢性炎癥是肥胖患者體內的狀態，白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、IFN等是最常見的炎癥因子[12-13]。本研究旨在探討肥胖導致乙肝患者IFN治療敏感性下降的機制與炎癥細胞因子的關系，為乙肝患者的個體化治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017-2021年在山東省千佛山醫院診治的HBV感染且行IFN治療的患者91例為研究對象，其中男62例，女29例。根據體質量指數(BMI)將其分為對照組(BMI≤25 kg/m2，61例)和肥胖組(BMI≥28 kg/m2，30例)，跟蹤IFN治療48周，檢測谷氨酸氨基轉移酶(ALT)和乙肝表面抗原(HBsAg)變化。收集該院健康查體人群(無基礎疾病，25人)血漿，根據BMI指數分為A組(BMI≤25 kg/m2)15人，B組(BMI≥28 kg/m2)10人，行流式細胞術檢測細胞因子，篩選靶點。

乙肝患者納入標準：(1)于該院就診的確診為HBV感染的成年門診和住院患者；(2)無重大遺傳性疾病家族史，未見同時患有其他感染性疾病或自身免疫性肝炎等。(3)治療期間無飲酒、輸血、懷孕、血色病等的發生。

1.2方法

1.2.1流式細胞術檢測炎癥細胞因子 儀器為BD FACS CantoTMⅡ型，試劑盒為青島瑞斯凱爾生物科技有限公司生產的8種細胞因子檢測試劑盒(多重微球流式免疫熒光發光法)。主要包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、TNF-α、IFN-γ。具體操作及分析步驟參照試劑盒說明書進行。

1.2.2細胞培養 培養穩定轉染人HBV基因組的HepG 2.2.15細胞，培養液為10%胎牛血清-DMEM，添加2 mmol/L谷氨酰胺，100 IU/mL青鏈霉素。接種24 h后按分組分別加入IFNα2b(500 IU/mL)，IL-2、IL-6、IL-10、IL-17(10 ng/mL)單獨及聯合作用于細胞3 d，更新培養基及對應藥物后繼續作用3 d，收集細胞或上清液，用于后續實驗。

1.2.3蛋白質印跡法(Western-blot)檢測 借助RIPA細胞裂解液提取蛋白質，Bradford法對蛋白進行定量，以β-actin為內參照基因，檢測JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1、STAT2、p-STAT2的蛋白表達水平，抗體均來自Cell Signaling Technology公司，使用濃度為1∶1 000。二抗為中杉金橋的HRP標記的羊抗兔二抗。

1.2.4實時熒光定量PCR(qPCR) 采用Trizol法提取細胞總RNA，借助Nanodrop 2000檢測RNA的濃度和純度，基于cDNA合成試劑盒(thermo scientific，貨號k1622)進行反轉錄，進一步借助SYRB(applied biosystems，貨號A25742)進行PCR擴增。擴增程序為： 50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40個循環。IFITM1上游引物為5′-CCAAGGTCCACCGTGATTAAC-3′,下游引物為5′-ACCAGTTCAAGAAGAGGGTGTT-3′；MX1上游引物為5′-GTTTCCGAAGTGGACATCGCA-3′，下游引物為5′-CTGCACAGGTTGTTCTCAGC-3′；OAS1上游引物為5′-TGTCCAAGGTGGTAAAGGGTG-3′，下游引物為5′-CCGGCGATTTAACTGATCCTG-3′；PKR上游引物為5′-GCCGCTAAACTTGCATATCTTCA-3′，下游引物為5′-TCACACGTAGTAGCAAAAGAACC-3′。

1.2.5生化及免疫指標檢測 ALT、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)均使用羅氏診斷公司生化分析儀及試劑盒分別通過比色法測定；HBsAg、乙型肝炎e抗原(HBeAg)使用希森美康HBsAg/HBeAg定量系統通過電化學發光法檢測。

1.2.6HBV-DNA檢測 通過羅氏Cobas AmpliPrep/cobas TaqMan48病毒載量檢測系統，使用羅氏HBV核酸檢測試劑盒檢測，跟隨檢測質控，質控合格。

1.3觀察指標

1.3.1RevMan軟件分析 綜合檢索國內外文獻，將肥胖設為唯一影響因素，基于篩選出的文獻提取數據，將數據分為乙肝治療有效組與乙肝治療無效組。采用RevMan軟件分析肥胖與乙肝治療的關系。

1.3.2IFN治療 臨床患者跟蹤IFN治療48周，統計其治療終點時的ALT、HBsAg等指標差異，并繪制散點圖對其進行分析，同時分析BMI與上述指標的相關性，觀察肥胖對臨床IFN治療的效果影響。

1.3.3流式細胞術 借助流式細胞術檢測A組與B組主要差異的細胞因子，作為體外實驗的切入點。

1.3.4體外細胞培養 收集上清液，采用化學發光法檢測HBsAg、HbeAg水平，磁珠法檢測HBV-DNA。觀察不同藥物作用下，3種指標變化趨勢，探索藥物對HepG 2.2.15細胞系表觀的影響。

1.3.5JAK-STAT信號通路和抗病毒蛋白檢測 收細胞蛋白及RNA，Western-blot實驗檢測JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1、STAT2、p-STAT2抗體；qPCR實驗檢測抗病毒蛋白引物IFITM1、MX1、OAS1、PKR水平。

2 結 果

2.1RevMan軟件結果 結果顯示，乙肝治療有效組和乙肝治療無效組優勢比為3.85(95%CI2.36～6.27)，提示肥胖是乙肝治療有效的不利因素。

2.2兩組ALT、HBsAg水平比較 對照組ALT水平為(43.54±20.37)U/mL，肥胖組ALT水平為(60.63±32.85)U/mL，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組HBsAg水平為(2 977.90±1 412.57)IU/mL，肥胖組HBsAg水平為(3 024.43±1 586.76)IU/mL，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為兩組ALT水平均值散點圖。B為兩組HBsAg水平均值散點圖。

2.3各組不同條件下各項指標水平比較 流式細胞術檢測結果發現，IL-4、IL-12p70、TNF-α、IFN-γ水平在A組和B組中比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而IL-2、IL-6、IL-10、IL-17水平在B組中明顯升高(P<0.05)，有參考意義，作為研究切入點進行后續實驗。見圖2A。

分別以IL-2、IL-6、IL-10、IL-17作用于體外培養的人HepG2.2.15細胞后，檢測結果發現上述4種IL單獨作用均能夠下調HbsAg水平，尤其是IL-2、IL-17下調作用明顯(P<0.05)，但是IL和IFN聯合作用未見明顯變化(P>0.05)；HbeAg、HBV-DNA水平較對照組均無明顯變化(P>0.05)。見圖2B。

注：A為A組、B組各項指標水平比較；B為IL-2、IL-6、IL-10、IL-17對HepG2.2.15細胞分泌的HBsAg、HBeAg和HBV-DNA水平的影響。

2.4IL在IFNα2b作用下對JAK-STAT信號通路的影響 IL-2、IL-6、IL-10和IL-17均激活了JAK-STAT信號通路，使JAK1、STAT1、STAT2發生不同程度的磷酸化。其中IL-6、IL-10降低JAK1-STAT磷酸化的程度尤其明顯。見圖3。

圖3 IL在IFNα2b作用下對JAK-STAT信號通路的影響

2.5IL促進抗病毒蛋白IFITM1、MX1、OAS1、PKR的表達 qPCR檢測結果發現，IFN單獨作用下，抗病毒蛋白IFITM1、MX1、OAS1、PKR水平升高，與IL共同作用下上述指標水平升高更加明顯(P<0.05)。見圖4。

圖4 IL促進抗病毒蛋白IFITM1、 MX1、 OAS1、PKR的表達

3 討 論

本研究追蹤臨床乙肝患者IFN治療48周后主要指標變化，并結合臨床，通過查閱、分析文獻等方式，發現肥胖是影響乙肝患者治療效果的因素之一，肥胖導致乙肝患者IFN治療敏感性下降。通過流式細胞術篩查BMI≥28 kg/m2與BMI≤25 kg/m2個體之間的炎癥細胞因子差異，以有統計學意義的IL-2、IL-6、IL-10、IL-17水平為切入點，作用于體外培養的肝HepG 2.2.15細胞，發現4種IL能夠激活JAK-STAT信號通路，促進抗病毒蛋白表達。因此，肥胖抑制IFN抗乙肝治療的效果不是與炎癥因子水平升高直接相關。推測炎癥與免疫的相互作用是主要分子機制，也是課題組下一步研究的重心。

本研究Western-blot結果驗證了JAK-STAT信號通路的激活，這與已有研究一致[14-15]。急性期蛋白IL-6最近被認為在肝癌發生中發揮了突出作用，激活caspase-8形成“壞死體”，誘導肝細胞壞死的發生[16-17]。有研究表明，IL-10/HBV-DNA被認為是預測IFN-α治療反應譜的有用指標[18]。血清IL-10水平可能反映了宿主免疫激活的情況[19-21]。在本研究中，筆者以IL-2、IL-6、IL-10、IL-17這些炎癥因子為切入點，發現肥胖體質導致上述指標水平升高，促進IFN抗病毒。但是本研究是體外細胞培養實驗，脫離了體內免疫系統，不排除IL影響機體免疫系統調控IFN抗病毒過程。

本研究采用了多種數據分析方式和研究手段，探索回顧IFN治療乙肝的分子生物學機制，通過臨床試驗與基礎研究相結合，綜合流式細胞術與細胞培養等實驗技術，實驗結果較為豐富。但是數據分析過程中，細胞上清液檢測數據不甚理想，考慮與藥物作用時間過短有關。單純體外細胞實驗的結果提示IL促進IFN抗病毒，分析其原因與炎癥和免疫系統錯綜復雜的關系密切相關，獨立因素下的研究不能反映機體實際情況。通過體內實驗，聚焦炎癥和免疫系統相互作用，尋找肥胖抑制IFN抗乙肝治療的機制是下一步的重點方向。

綜上所述，肥胖降低了乙肝患者IFN治療的敏感性，并導致體內IL-2、IL-6、IL-10及IL-17水平不同程度升高。單純的IL具有抗炎作用，促進IFN抗乙肝。但是在免疫系統共存的個體內，推測肥胖致IFN治療敏感性下降與炎癥和免疫系統的復雜關系有關，課題組將繼續深入研究。