KLF17、VGLL4在子宮內膜樣腺癌中的表達水平與臨床病理特征的相關性

陳海紅 胡慶蘭 蔣學風 羅志峰 劉海紅

子宮內膜癌（endometrial cancer，EC）是來源于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤。每年有接近20萬的新發病例，占全世界女性癌癥病例的近5%，死亡人數的占比超過2%，是導致死亡的第三大常見婦科惡性腫瘤。子宮內膜癌的發病率、病死率上升，呈現年輕化趨勢，嚴重威脅女性身體健康[1-2]。子宮內膜樣腺癌是EC中最常見的病理類型，探索其致病機理，尋找預防、治療子宮內膜樣腺癌的新方法具有重要的臨床意義。

上皮-間質轉化（EMT）對于腫瘤細胞的作用是很重要的[3]。在Dong等[4]子宮內膜癌研究中，Kruppel樣因子17（KLF17）通過反激活TWIST1來調節啟動EMT而發揮致癌作用，KLF17在人子宮內膜細胞表達上調。

轉錄輔助因子退變樣蛋白4（VGLL4）是轉錄增強因子（TEAD）的新伙伴，在子宮內膜腺上皮組織中有表達且起到腫瘤抑制作用[5]?；诖?，本試驗通過免疫組化法了解KLF17、VGLL4在子宮內膜樣腺癌中的表達情況，分析KLF17、VGLL4在子宮內膜樣腺癌中的病理差異性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年6月-2020年4月，從清遠市婦幼保健院婦產科收集91例標本的臨床資料。納入標準：（1）術后經病理檢查確診；（2）術前未進行化療、放療或生物靶向治療。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）艾滋病等累及免疫功能的疾病。其中22例為正常子宮內膜組織標本，28例經病理診斷為子宮內膜單純性增生組織標本，41例為子宮內膜樣腺癌組織標本。41例的子宮內膜樣腺癌組織標本中，年齡35～72歲，中位年齡52歲。根據病理分化程度，高分化18例，中分化14例，低分化9例。根據2019年FIGO分期標準進行分類：34例Ⅰ、Ⅱ期和7例Ⅲ、Ⅳ期。肌層浸潤深度＜1/2者30例，≥1/2者11例。包括：6例有淋巴結轉移，35例無淋巴結轉移。28例子宮內膜單純性增生組織標本中，年齡30～69歲，中位年齡49歲，病程3～8個月，平均（5.64±0.61）個月；22例正常子宮內膜組織標本中，年齡36～70歲，中位年齡55歲。以上石蠟切片及病理標本均由2名病理專家重新閱片、復核證實。本研究符合倫理學標準，并通過清遠市婦幼保健院倫理委員會批準。

1.2 方法

儀器：光學顯微鏡（XSP-C204）；成像系統；全自動LEICA免疫組化染色系統等。試劑：Rabbit anti-KLF17 antibody（ 武 漢 三 鷹 ）、Rabbit anti-VGLL4 antibody（abclonal）、免疫組織化學 S-P 檢測試劑盒（servicebio）及DAB顯色試劑盒（servicebio）。選取石蠟標本，連續切成厚4 μm的切片，所有切片均予防脫載玻片撈取標本，置于60 ℃烤片機烤片40 min以上，以防止脫片。嚴格按照試劑盒的說明，采用免疫組化學SP法進行脫蠟、水化、抗原修復、加一抗、孵育、加二抗、復染、閱片等步驟。試驗陰性結果：PBS液代替一抗所得出的結果。試驗的陽性對照：睪丸組織中KLF17陽性表達，胎盤組織中VGLL4陽性表達結果，顯色為棕黃色。

1.3 觀察指標及評價標準

KLF17、VGLL4主要表達于細胞核中；對每張載玻片隨機選取10個高倍鏡視野，觀察染色強度并計分：分為0分（不存在）、1分（淺黃色）、2分（棕黃色）、3分（棕褐色）。計數染色陽性細胞占比及得分：分為0分（＜5%）、1分（5%～25%），2分（26%～50%）、3分（51%～75%）、4分（76%～100%）。IRS是染色強度得分和陽性染色細胞得分的總和（范圍 0～7分），0～2分：-；3～4分：+；5～6分：++；7分：+++。其中 KLF17的IRS≥5分是高（陽性）表達，IRS≤4分是低（陰性）表達；VGLL4的IRS≥4分是高（陽性）表達，IRS≤3分是低（陰性）表達。

1.4 統計學處理

試驗數據資料的歸納整理，本研究相關試驗結果是運用SPSS 19.0進行統計。計數資料以率（%）表示，臨床指標比較采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗，比較KLF17與VGLL4表達的相關性采用χ2檢驗及Spearman分析。檢驗標準是α=0.05；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KLF17與VGLL4在子宮內膜樣腺癌、子宮內膜單純性增生及正常子宮內膜組織中的表達

KLF17在子宮內膜樣腺癌、子宮內膜單純性增生、正常子宮內膜中陽性率分別占80.5%（33例）、25.0%（7例）、18.2%（4例），差異有統計學意義（P＜0.05）。VGLL4在子宮內膜樣腺癌、子宮內膜單純性增生、正常子宮內膜中陽性率分別占24.4%（10例）、71.4%（20例）、77.3%（17例），差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 KLF17和VGLL4在不同組織內膜中的表達

2.2 KLF17和VGLL4的表達與子宮內膜樣腺癌臨床病理特征的相關性分析

KLF17在子宮內膜樣腺癌中的陽性表達率在不同年齡組間、FIGO分期（Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ、Ⅳ）、肌層浸潤深度是否小于1/2、分化程度及有無淋巴結轉移中比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。VGLL4在子宮內膜樣腺癌中的表達陽性率在不同年齡組、FIGO分期（Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ、Ⅳ）、肌層浸潤深度是否小于1/2、有無淋巴結轉移比較，差異無統計學意義（P＞0.05），而與分化程度有相關性，分化程度越高，表達越強（P＜0.05），見表2。

表2 KLF17和VGLL4的表達與子宮內膜樣腺癌臨床病理特征的關系（例）

2.3 VGLL4表達與子宮內膜樣腺癌分化程度的相關性分析

在人子宮內膜樣腺癌組織中，提示VGLL4表達與子宮內膜樣腺癌分化程度存在正相關（r=0.346，P＜0.05），見表 3。

表3 VGLL4表達與子宮內膜樣腺癌分化程度的相關性分析（例）

2.4 KLF17與VGLL4在子宮內膜樣腺癌中表達的相關性分析

在人子宮內膜樣腺癌組織中，KLF17表達與VGLL4表達存在負相關性（r=-0.437，P＜0.05），見表4。

表4 KLF17與VGLL4在子宮內膜樣腺癌中表達的相關性（例）

3 討論

子宮內膜癌是惡性上皮性腫瘤，高危因素有早初潮和晚絕經、不孕和不育、年齡增長、肥胖等。子宮內膜癌的發生與發展是由多種信號轉導通路及基因異常相互作用的結果，是一組異質性的疾病[6-7]。KLF17作為激活劑或抑制劑發揮作用，取決于與不同的啟動子及相互作用的結合蛋白，對腫瘤起到雙向調節的作用，KLF17是子宮內膜癌上新發現的誘導EMT的因子。VGLL4可抑制EMT[8]。KLF17能夠通過其鋅指結構結合在靶基因富含G/C序列的啟動子區，進而啟動或抑制下游基因的表達[9]。本研究得出，KLF17與年齡、FIGO分期、肌層浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移的比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。有研究中指出KLF家族的成員可以根據細胞和啟動子環境來選擇充當轉錄的激活劑或阻遏劑，或兩者兼有[8]。KLF17的作用功能取決于啟動子的功能及啟動子所處的微環境。本研究中提示，KLF17在子宮內膜樣腺癌組織中明顯表達上調。KLF17作為跨膜絲氨酸蛋白酶corin（CRN）的轉錄調節因子，表達上調后參與妊娠子宮的調節和生理。因KLF17有反式激活的能力，在子宮內膜癌中是表達上調的。本研究與Dong等[4]研究中發現相一致，在KLFs家族中，KLF（1、4、5、10、13、16和17）在子宮內膜癌細胞系中顯著上調，KLF（2、7、8、9、11、12、14和15）表達下調。KLF17通過結合TWIST1啟動子反激活TWIST1。被激活的TWIST1通過直接抑制上皮標志物E-鈣黏蛋白致多梳狀蛋白-1（BMI-1）表達上調或TWIST1直接上調BMI-1的表達來促進EMT[10-11]。在Shen等[12]研究中指出：TWIST1的陽性表達：正常＜不典型增生＜Ⅰ型EC。與本文研究提示KLF17的陽性率呈遞增趨勢相一致。子宮內膜腺癌中高表達的TWIST1與KLF17結合，促進癌癥的發生及發展。KLF17下調的情況在乳腺癌[13]、口腔癌[14]等研究中提示與癌組織TNM分期呈負相關，提示預后不良。本研究與臨床病理特征無相關性，或許KLF17單純的參與子宮內膜樣腺癌的發生，或許是試驗樣本中病理類型較單一，子宮內膜樣腺癌的預后良好，細胞分化良好，弱化其與臨床病理特征的關聯性，而標本數量相對較少及晚期病例不足等引起。

YAP作為原癌基因與TEAD結合，在Hippo通路中起到致癌作用。VGLL4作為體內YAP蛋白的抑制劑，競爭性結合TEAD，形成VGLL4-TEADs復合物，作用于Hippo途徑的末端靶向轉錄機制，調控Hippo信號通路，達到有效地抑制腫瘤的形成和發展。有研究指出，VGLL4和YAP在調節腫瘤免疫中起到核心作用[15]。另外，VGLL4還作為人類胚胎干細胞存活的正調節因子[16]?；谏鲜隼碚摶A，VGLL4在多種腫瘤中表達普遍下調，本試驗研究通過免疫組化法檢測VGLL4的表達，結果分析得出，VGLL4在10例（24.4%）病例中呈陽性，子宮內膜樣腺癌組中VGLL4的陽性表達低于子宮內膜單純性增生組，低于內膜正常組織中的表達。VGLL4陽性表達率與患者年齡、FIGO分期、肌層浸潤深度、淋巴結轉移的比較無相關性，與腫瘤的分化程度有關，分化程度越高，表達越強，差異有統計學意義（r=0.346，P＜0.05），這與Kim等[17]研究相似，Kim等[17]的研究中指出VGLL4在164例（55.6%）結直腸癌患者中呈陽性，腫瘤體積大小、pT分級高低、有無淋巴結轉移均與其相關。有研究指出，YAP在子宮內膜癌中過表達與細胞增殖、侵襲和遷移顯著相關[18]。TEAD在子宮內膜癌細胞中高表達[19]。在子宮內膜腺癌中，VGLL4表達下調，YAP表達上調，TEAD表達上調。下調的VGLL4的拮抗作用減弱，機體中YAP-TEADs復合物形成增多，同時VGLL4抑制YAP-TEADs復合物活性的作用減弱，促進腫瘤的發生及發展，與本研究結果相一致。有研究指出，VGLL4mRNA異常水平與胃腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴管浸潤和淋巴結轉移呈負相關[20]，與本研究結果不相符，可能與本研究中晚期及復發性轉移的標本量太少有關。VGLL4作為腫瘤抑制基因，在子宮內膜癌中表達下調。在正常子宮內膜、子宮內膜單純性增生、子宮內膜樣腺癌三組組織中，VGLL4的表達呈逐漸下降趨勢，可能與內膜病變的發生發展有關。

隨著子宮內膜樣腺癌的相關研究越來越多，疾病的發生逐漸年輕化[21]。EMT是腫瘤發生過程中有重要作用。E-鈣黏蛋白的喪失在EMT發生的不可或缺的事件之一。VGLL4過表達增加E-鈣黏蛋白的表達水平并降低β-catenin的表達水平，部分可通過負調控Wnt/β-catenin信號傳導途徑抑制EMT，抑制癌癥的侵襲及轉移[22]。而TWIST1作為KLF17結合的啟動子，直接抑制E-鈣黏蛋白的表達誘導EMT促進癌癥的發生及發展。E-鈣黏蛋白的水平高低影響EMT的發生及發展。本試驗結果表明：在33例KLF17陽性表達的人子宮內膜樣腺癌標本中，有28例VGLL4表達陰性；在31例VGLL4表達陰性的人子宮內膜樣腺癌樣本中，有28例KLF17樣本表達陽性，兩者呈負相關性。兩者在子宮內膜樣腺癌中的作用有可能是相反的，這或許是相互作用，又或許是獨立存在的因子。本試驗研究顯示，KLF17的表達在正常子宮內膜、子宮內膜單純性增生、子宮內膜樣腺癌三組組織中呈上調趨勢，VGLL4的表達在正常子宮內膜、子宮內膜單純性增生、子宮內膜樣腺癌三組組織中呈下調趨勢，這表明在癌變的過程中，內膜組織中KLF17、VGLL4發生變化。但本試驗只反映出其變化的趨勢，不排除有某種調節機制：KLF17、VGLL4對E-鈣黏蛋白的表達水平的影響，從而影響子宮內膜樣腺癌的發生過程，這只是其中一個方面，是否還有多個方面或機制聯系KLF17、VGLL4參與子宮內膜樣腺癌的發生，其具體變化需進一步完善更全面的試驗和綜合分析。在后續的試驗研究中將加大臨床病例數，搜集子宮內膜伴有不典型增生組織，增設試驗分組，以及定量檢測KLF17、VGLL4的表達水平，具體了解其在正常子宮內膜-子宮內膜單純性增生-子宮內膜樣腺癌發生軸中是否存在量的變化趨勢，從而研究KLF17和VGLL4的表達水平與子宮內膜病變程度之間的關系。

綜上所述，在子宮內膜樣腺癌中，KLF17表達的上調和VGLL4表達的下調共同參與腫瘤的發生及發展，二者可能與內膜病變的發生發展有關。