陽江地區236例羊水地中海貧血基因的產前診斷＊

曾瑞華 許秀蘭 黃平 曾昭珊

地中海貧血是常染色體隱性單基因遺傳病[1]。輕型患者無癥狀，不影響日常生活工作，稱為攜帶者，若與同型地中海貧血的攜帶者婚配、生育，根據地中海貧血遺傳規律，將會有25%概率生育中型、重型地中海貧血患兒，需定期輸血維持生命，嚴重影響患者的生存質量，甚至威脅生命，影響本地區的人口質量[2]。陽江地區位于粵西，人口200萬，是地中海貧血高發區，廣東省2012年大規模流調數據顯示，攜帶同型地中海貧血基因的夫婦高達1.87%（這個是引用廣東省2012年大規模流調的數據），如果不加予干預，每年將會有大量中重型地中海貧血患兒出生。陽江市婦幼保健院對懷孕中期攜帶同型地中海貧血基因的夫婦進行羊膜腔穿刺術，抽取羊水進行地中海貧血基因分析，查出重型地中海貧血患兒，終止妊娠，保障母嬰健康，提高本地區人口素質，更好地完成出生缺陷防控工作。本研究統計分析了2019年6月-2021年4月陽江市婦幼保健院、陽西縣婦幼保健院、陽江市江城區平崗醫院、陽江市陽東區婦幼保健院抽取羊水檢查的236例孕婦的臨床資料，分析了陽江地區同型地中海貧血夫婦的羊水地中海貧血基因的產前診斷情況，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年6月-2021年4月于陽江市婦幼保健院、陽西縣婦幼保健院、陽江市江城區平崗醫院、陽江市陽東區婦幼保健院抽取羊水檢查的236例孕婦的臨床資料。納入標準：（1）均具有平穩的生命體征；（2）均為單胎；（3）夫妻兩人為同型地中海貧血。排除標準：（1）合并妊娠期并發癥；（2）合并惡性腫瘤。年齡20～47歲，平 均（33.62±5.46） 歲； 孕 周 16～26周， 平 均（18.32±1.05）周。在孕婦類型方面，初產婦120例，經產婦116例。本研究通過醫院醫學倫理委員會批準，孕婦均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 讓孕婦適當活動，B超監護下經母腹實施羊膜腔穿刺術，選取髂前上棘和臍連線的中點處確定穿刺點，常規消毒腹部皮膚，鋪洞巾，經皮用22G活檢穿刺針，穿刺羊膜腔，抽取20 ml無菌羊水，分裝在2支15 ml無菌離心管中送檢。

1.2.2 DNA提取 標本送實驗室進行DNA提取，具體操作為：抽取1管羊水，速率為2 500 r/min，離心10 min，每管留取0.5 ml羊水沉渣，接種在25 ml細胞培養瓶中并添加3.5 ml美國Gibco公司生產的Amnio Max培養液，放置在100%濕度、37 ℃、5% CO2培養箱中，1周后觀察細胞生長情況。顯微鏡下見5、6個克隆細胞，每個克隆細胞含50～200個克隆羊水細胞，同時，在細胞克隆時，收獲具有較強折光性、較多圓形分裂細胞。向15 ml無菌離心管中轉移羊水細胞；另1管羊水離心10 min，速率為4 000 r/min，去除上清液，保留沉淀物（羊水細胞），向1.5 ml離心管中轉移，應用離心柱型微量樣品基因組DNA提取試劑盒（凱普有限公司）進行DNA提取，將蛋白酶K、細胞裂解液加入離心管中消化，向吸附柱轉移裂解液，進行DNA洗脫。

1.2.3 DNA擴增 （1）運用Gap-PCR法檢測α-缺失型地中海貧血--SEA/、-α3.7/、-α4.2/三種缺型。α-缺失型擴增程序：在96 ℃的溫度下擴增5 min，在98 ℃、65 ℃、72 ℃的溫度下分別擴增 45 s、90 s、3 min，共 10 個循環，在 98 ℃、65 ℃、72 ℃的溫度下分別擴張 30 s、45 s、3 min，共 25 個循環，在 72 ℃的溫度下擴增 10 min；（2）運用 PCR- 反向點雜交法對α-非缺失型、β-地中海貧血突變CD14-15、CD17、CD27/28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD41-42、CD43、CD71-72、ⅠVS-Ⅱ-28、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、IVS-Ⅱ-654、Ⅰnt、βE、CAP、αWSα、αCSα、αQSα三種突變進行檢測。α-非缺失型、β-地中海貧血突變擴增程序：在50 ℃、95 ℃的溫度下分別擴增 15、10 min，在94 ℃、55 ℃、72 ℃的溫度下分別擴增 60、30、30 s，共35個循環，在72 ℃的溫度下擴增5 min；（3）采用PCR擴增儀（Hema 9600），應用地中海貧血基因檢測試劑盒（深圳亞能生物技術有限公司）擴增。

1.2.4 電泳和雜交 （1）α-缺失型地中海貧血將2 μl擴增產物取出來，在5 V/cm電壓下用含核酸染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳1 h，在黑馬凝膠成像系統上觀察結果；（2）α-非缺失型、β-地中海貧血突變檢測。在42 ℃的溫度下在恒溫水浴搖床上雜交1.5～4 h，洗膜，顯色后觀察結果。

1.3 觀察指標

（1）觀察陽江地區同型地中海貧血夫婦均為α-地中海貧血的羊水地中海貧血基因的產前診斷結果；（2）觀察陽江地區同型地中海貧血夫婦均為β-地中海貧血的羊水地中海貧血基因的產前診斷結果。

1.4 統計學處理

本研究數據采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析和處理，計量資料用（±s）表示。

2 結果

2.1 陽江地區同型地中海貧血夫婦均為α-地中海貧血的羊水地中海貧血基因的產前診斷結果分析

236例中，夫妻雙方均為α-地中海貧血168例，均為單胎，其胎兒重型α-地中海貧血22例，中間型α-地中海貧血29例，輕型α-地中海貧血60例，靜止型α-地中海貧血22例，正常35例， 分 別 占 13.10%、17.26%、35.71%、13.10%、20.83%，見表1。

表1 陽江地區同型地中海貧血夫婦均為α-地中海貧血的羊水地中海貧血基因的產前診斷結果分析

2.2 陽江地區同型地中海貧血夫婦均為β-地中海貧血的羊水地中海貧血基因的產前診斷結果分析

236例中，均為β-地中海貧血的夫妻68例，均為單胎，其中重型/中間型β-地中海貧血16例，輕型β-地中海貧血32例，正常20例，分別占23.53%、47.06%、29.41%，見表2。

表2 陽江地區同型地中海貧血夫婦均為β-地中海貧血的羊水地中海貧血基因的產前診斷結果分析

3 討論

地中海貧血又稱海洋性貧血或珠蛋白合成障礙性貧血，是常染色體隱性單基因遺傳病[3]。由于珠蛋白鏈合成缺如或不足所導致的貧血或病理狀態。緣于基因缺陷的復雜性與多樣性，使缺乏的珠蛋白鏈類型、數量及臨床癥狀變異性較大[4]。根據所缺乏的珠蛋白鏈種類及缺乏程度予以命名和分類。本病廣泛分布于世界許多地區，東南亞即為高發區之一[5]。

基因珠蛋白鏈的分子結構及合成是由基因決定的。γ、δ、ε和β珠蛋白基因組成“β基因族”，ζ和α珠蛋白組成“α基因族”[6]。正常人自父母雙方各繼承2個α珠蛋白基因（αα/αα）合成足夠的α珠蛋白鏈；自父母雙方各繼承1個β珠蛋白基因合成足夠的β珠蛋白鏈[7-8]。由于珠蛋白基因的缺失或點突變，肽鏈合成障礙導致發病，根據缺失或者突變的基因數目多少導致貧血的程度又分為輕、中、重度貧血[9-12]。地中海貧血分為α型、β型、δβ型和δ型4種，其中以β和α地中海貧血較為常見[13-15]。

本研究結果表明，236例中，夫妻雙方均為α-地中海貧血168例，其中診斷為重型α-地中海貧血22例，中間型α-地中海貧血29例，輕型α-地中海貧血60例，靜止型α-地中海貧血22例，正常35例，分別占13.10%、17.26%、35.71%、13.10%、20.83%。均為β-地中海貧血的夫妻68例，其中重型/中間型β-地中海貧血16例，輕型β-地中海貧血32例，正常20例，分別占23.53%、47.06%、29.41%。據此能夠將有效依據提供給終止妊娠與否，進而促進新生兒出生缺陷的降低，從而減輕家庭及社會的負擔。

綜上所述，陽江地區同型地中海貧血夫婦的羊水地中海貧血基因的產前診斷能夠實現地中海貧血的早診斷，早干預，預防重型地中海貧血患兒的出生，減輕家庭及社會經濟負擔，提升人口素質。