miR-145-5p通過靶向PAK4促進非小細胞肺癌對吉非替尼的敏感性

李鋒 薛華 王小衛 梁杰 翟梅

(咸陽市第一人民醫院 1急診科，陜西 咸陽 712000；2老年科二病區；3呼吸與危重癥醫學科)

肺癌是世界范圍內最常見的癌癥之一，在全球范圍內，每年有超過 1 410 萬新的肺癌患者被診斷出患有肺癌，估計每年有 820 萬例患者死亡。非小細胞肺癌是肺癌的主要類型，由于缺乏明顯的早期癥狀和檢測方法，非小細胞肺癌的診斷通常處于中晚期〔1,2〕。吉非替尼，一種酪氨酸激酶抑制劑，已經被美國食品和藥物管理局批準用于非小細胞肺癌的治療〔3〕。但是由于耐藥性的發生，吉非替尼在非小細胞肺癌的治療作用減弱，導致化療失敗〔4〕。因此，探索新的分子靶標和作用機制以改善非小細胞肺癌的治療。微小RNA(miRNA)與各種腫瘤的發生密切相關，并且可以通過調節靶mRNA在腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化和轉移中發揮重要作用。miR-145 在非小細胞肺癌組織中的表達下調，miR-145 低表達不僅與非小細胞肺癌的低分化和較晚分期相關，還與淋巴結轉移相關〔5〕。p21活化激酶(PAK)4是Rho家族蛋白Cdc42的效應子，是一種重要的致癌基因，在許多人類癌癥中表達增加，通常與晚期疾病和生存期下降呈正相關。PAK4表達增加與轉移、總生存期縮短、NSCLC晚期相關〔6〕。本文旨在探究miR-145-5p對非小細胞肺癌對吉非替尼的敏感性的作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 20只裸鼠購自四川夏派森醫藥科技有限公司，許可證：SYXK(川)2017-203，用于異種移植瘤模型。飼養光照/黑暗周期為12 h，維持(24±2)℃恒溫，濕度為55%～60%。所有裸鼠可自由獲得水和食物。

1.2主要試劑及儀器 BEAS-2B細胞、A549細胞和A549耐吉非替尼細胞(A549/GR)購自美國典型培養物保藏中心；miR-NC、miR-145-5p inhibitor、miR-145-5p mimic、pc-PAK4質粒及各種引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成；RPMI-1640培養基購自武漢純度生物科技有限公司；胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液購自上海吉至生化科技有限公司；cDNA逆轉錄試劑盒購自上海博爾森生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；SYBR-Green PCR試劑盒購自武漢時勝生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、PAK4兔來源的單克隆抗體均購自熒光Abcam公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自北京科睿思訊生物科技有限公司；FluorChem HD2凝膠成像系統購自美國Invitrogen公司；流式細胞儀購自德國美天旎生物技術有限公司。

1.3細胞及培養 標準培養條件下，在含有10%胎牛血清，培養基中培養所有細胞，在37℃含5%CO2和95%的濕空氣中孵育。

1.4RT-qPCR檢測miR-145-5p和PAK4 mRNA的表達 用Trizol法從細胞中提取總RNA，應用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。參照RT-qPCR試劑盒說明書反應體系進行qPCR。反應條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，45個循環。以U6和GAPDH為內參基因，用2-△△Ct計算相對表達量。引物序列為：PAK4上游：5′-CGGATATTGTCACCCACACCA G-3′，PAK4下游：5′-CTAACAGGGACAGGA GCT-3′；GAPDH上游：5′-ACTGTGCCGACTTGACG TTT-3′，GAPDH下游：5′-ATCGTAGTGAACGGTCG ATTGT-3′；miR-145-5p上游：5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAA TCCCT-3′，miR-145-5p下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；U6上游：5′-CAGCACATATACTAAAATTGGAACG-3′，U6下游：5′-ACGAATTTGCGTGTCATCC-3′。

1.5細胞轉染 以5×105個/ml的密度將A549/GR細胞接種于12孔板中，約80%匯合度時使用Lipofectamine2000進行轉染，將100 nmol/L的miR-NC(miR-NC組)、miR-145-5p mimic(miR-145-5p mimic組)、miR-145-5p inhibitor(miR-145-5p inhibitor組)、pc-PAK4質粒分別或聯合轉染進入A549/GR細胞，未轉染的A549/GR細胞為對照組。

1.6噻唑藍(MTT)法檢測細胞活性 取對數生長期A549/GR細胞，調整細胞密度為3×104/ml，接種于96孔板中，按方法1.5分組處理，每孔加入MTT溶液(50 μl/孔)，孵育4 h，吸出上清液，每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，用平板搖床搖勻，用酶標儀在570 nm處檢測各劑量OD值。

1.7流式細胞法檢測細胞的凋亡 取按方法1.5處理后的各組A549/GR細胞，用胰酶消化后收集，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入1 ml結合緩沖液重懸細胞，使濃度為1×106/ml，嚴格按照膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒說明書上機分析。

1.8雙熒光素酶報告檢測靶向關系 TargetScan數據庫檢索結果顯示PAK4是miR-145-5p的潛在靶點。選用熒光素酶報告分析，構建野生型(Wt)和突變型(Mut)PAK4 3′UTR區熒光素酶報告基因質粒，轉染至A549/GR細胞。將細胞隨機分為miR-NC+PAK4 Wt組(轉染PAK4 Wt)、miR-145-5p mimic+PAK4 Wt組(共轉染PAK4 Wt和miR-145-5p mimic)、miR-NC+PAK4 Mut組(轉染PAK4 Mut)和miR-145-5p mimic+PAK4 Mut組 (共轉染PAK4 Mut和miR-145-5p mimic)。采用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測細胞熒光素酶相對活性。

1.9Western印跡檢測PAK4蛋白相對表達水平 將各組A549/GR細胞加裂解液后提取總蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白含量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，4℃下加入一抗PAK4孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗HRP-IgG，室溫孵育1 h，TBST洗膜。通過Image LabTM軟件行灰度值分析。

1.10裸鼠體內實驗 所有裸鼠分為：空白組、miR-145-5p mimic組、pc-PAK4組、miR-145-5p mimic+pc-PAK4組。在裸鼠左腋下皮下注射轉染過的A549/GR細胞(每只小鼠在100 ml PBS中5×106個細胞)，在每個腫瘤達到肉眼可見的大小后，每隔一天給每只小鼠口服吉非替尼(100 mg/kg)。每隔4 d檢測腫瘤體積，在第24天，通過頸椎脫位法處死裸鼠，然后完整取出皮下腫瘤，用電子天平稱重，RT-PCR檢測小RNA和靶基因的表達，TUNEL染色檢測凋亡。

1.11TUNEL染色檢測細胞凋亡 取4%多聚甲醛固定的裸鼠腫瘤組織，石蠟包埋切片后，按TUNEL試劑盒操作說明進行檢測，光鏡下觀察并計數凋亡細胞。光鏡下棕黃色或褐色為陽性細胞即凋亡細胞。

1.12統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗，多重性比較采用Duncan法。

2 結 果

2.1miR-145-5p在 A549、A549/GR細胞中低表達 與正常肺細胞BEAS-2B(1.00±0.03)相比，A549(0.45±0.04)和A549/GR細胞中miR-145-5p表達(0.53±0.04)明顯降低(P<0.01)。與對照組(1.00±0.08)相比，miR-NC 組A549/GR細胞中miR-145-5p表達(0.98±0.09)無明顯變化(P>0.05)，miR-145-5p inhibitor 組A549/GR細胞中miR-145-5p表達(0.23±0.08)明顯降低，miR-145-5p mimic 組A549/GR細胞中miR-145-5p表達(3.62±0.11)明顯升高(P<0.01)，表明轉染成功。

2.2miR-145-5p促進 A549/GR細胞對吉非替尼的敏感性 隨著時間的增長，各組A549/GR細胞活性差異逐漸明顯；在相同時間點，與對照組相比，miR-NC 組A549/GR細胞活性無明顯變化(P>0.05)，miR-145-5p inhibitor 組A549/GR細胞活性從24 h開始明顯升高，miR-145-5p mimic 組A549/GR細胞活性從24 h開始明顯降低(P<0.05，P<0.01)，見表1。與對照組〔(21.32±9.25)%〕相比，miR-NC 組A549/GR細胞凋亡率〔(22.16±1.32)%〕無明顯變化(P>0.05)，miR-145-5p inhibitor 組A549/GR細胞凋亡率〔(14.27±1.16)%〕明顯降低，miR-145-5p mimic 組A549/GR細胞凋亡率〔(45.62±1.21)%〕明顯升高(P<0.05，P<0.01)，見表1、圖1。

2.3miR-145-5p靶向PAK4 與miR-NC+PAK4 Wt組(1.00±0.05)比較，miR-145-5p mimic+PAK4 Wt組熒光素酶活(0.45±0.06)明顯下調(P<0.01)，說明 miR-145-5p直接靶向作用于PAK4，見圖2。與正常肺細胞BEAS-2B(1.00±0.06、0.39±0.04)相比，A549(4.26±0.17、0.78±0.05)和A549/GR細胞PAK4 mRNA和蛋白表達(3.37±0.15、0.67±0.06)明顯升高(P<0.01)，見圖3。

表1 各組A549/GR細胞中細胞活性比較

圖1 流式細胞法檢測各組細胞的凋亡

圖2 通過TargetScan數據庫篩選出的miR-145-5p靶基因

圖3 Western印跡檢測PAK4 蛋白表達

2.4miR-145-5p通過靶向PAK4促進A549/GR對吉非替尼的敏感性 與空白組相比，miR-145-5p mimic組A549/GR細胞中PAK4蛋白表達明顯下調，A549/GR細胞活性明顯降低，細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；pc-PAK4組A549/GR細胞中PAK4蛋白表達明顯上調，A549/GR細胞活性明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與miR-145-5p mimic組相比，miR-145-5p mimic+pc-PAK4組A549/GR細胞中PAK4蛋白表達明顯上調，A549/GR細胞活性明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖、圖5、表2、表3。

2.5miR-145-5p促進A549/GR移植瘤對吉非替尼的敏感性 與空白組相比，miR-145-5p mimic組A549/GR移植瘤體積明顯減小，重量明顯減輕，miR-145-5p mRNA表達明顯上調，PAK4 mRNA表達明顯下調，細胞凋亡率明顯上升，差異有統計學意義(P<0.01)；pc-PAK4組A549/GR移植瘤體積明顯增大，重量明顯升高，miR-145-5p mRNA表達明顯下調，PAK4 mRNA表達明顯上調，細胞凋亡率明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)；與miR-145-5p mimic組相比，miR-145-5p mimic+pc-PAK4組A549/GR移植瘤體積明顯增大，重量明顯升高，miR-145-5p mRNA表達明顯下調，PAK4 mRNA表達明顯上調，細胞凋亡率明顯下降(P<0.01)，見圖6、圖7、表4、表5。

1～4：空白組，miR-145-5p mimic組，pc-PAK4組，miR-145-5pmimic+pc-PAK4組，下圖同圖4 Western印跡檢測各組PAK4 蛋白表達

圖5 流式細胞法檢測細胞凋亡

表2 各組A549/GR細胞中細胞活力比較

表3 各組A549/GR細胞中PAK4蛋白表達水平及細胞的凋亡率

圖6 各組A549/GR移植瘤

圖7 TUNEL染色檢測各組細胞凋亡(×200)

表4 各組A549/GR移植瘤體積比較

表5 各組A549/GR移植瘤重量、凋亡率、miR-145-5p 和PAK4 mRNA 表達水平比較

3 討 論

盡管近年來非小細胞肺癌的診斷和治療取得了很大的進展，但其復發率和死亡率仍然很高〔7〕。吉非替尼是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶的選擇性抑制劑，是治療晚期非小細胞肺癌的首個靶向藥物，吉非替尼在其應用過程中會產生抗藥性。最近，有大量研究報道了非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的耐藥性，對吉非替尼的耐藥性限制了其對非小細胞肺癌患者的治療效果〔8〕。如抑制miR-873可通過靶向與膠質瘤相關的致癌基因同源物1來增強非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的耐藥性〔9〕；姜黃素通過誘導自噬相關細胞死亡克服非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的原代耐藥〔10〕。 miRNA在癌細胞的增殖、新陳代謝的發展、遷移、侵襲、分化和耐藥性中起著重要作用。miR-145-5p在多種癌癥中發揮抑癌作用，如，miR-145過表達可觸發整個轉錄組的改變并抑制乳腺癌的發展〔11〕，miR-145-5p通過直接靶向KLF5影響胃癌的分化〔12〕。研究表明，miR-145通過靶向多藥耐藥相關蛋白-1使乳腺癌對阿霉素敏感〔13〕，miR-145通過直接抑制磷脂磷酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)信號通路使食管鱗癌對順鉑敏感〔14〕。本研究結果說明miR-145-5p促進 A549/GR細胞對吉非替尼的敏感性。

miRNA是一類小的非編碼RNA，它們與靶基因3′非翻譯區(3′UTR)中的特定序列結合，導致mRNA降解和(或)翻譯抑制。為更好地了解miR-145-5p對非小細胞肺癌的吉非替尼敏感性的作用機制，通過TargetScan數據庫發現miR-145-5p與PAK4存在靶向結合位點，并通過雙熒光素酶報告實驗驗證miR-145-5p與PAK4存在靶向作用。p21激活的激酶(PAK)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是Rac和Cdc42的下游效應子的最佳特征〔15〕。PAKs在幾種人類腫瘤(如乳腺癌、結腸癌、肺癌和胃癌)中過表達和/或過度活化，與癌癥的發展密切相關〔16〕。PAK4過表達與非小細胞肺癌的不良預后相關，并促進其遷移和侵襲〔17〕。PAKs通過調節Ras誘導的細胞周期進程和新陳代謝、上皮-間充質性上皮細胞轉化和血管生成與腫瘤發生密切相關。miR-193a-3p抑制Slug激活劑PAK4通過p53基因/鋅指轉錄因子/L1細胞黏附分子通路抑制非小細胞肺癌的侵襲性〔18〕；PAK4通過PI3K/AKT通路參與宮頸癌細胞的順鉑耐藥〔19〕；PAK4通過PI3K/AKT和絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調節蛋白激酶依賴途徑使胃癌細胞產生順鉑耐藥〔20〕。本研究表明，miR-145-5p通過靶向PAK4促進A549/GR對吉非替尼的敏感性。

通過體外實驗可知，miR-145-5p通過靶向PAK4促進A549/GR對吉非替尼的敏感性。為了更好地了解miR-145-5p通過靶向PAK4促進A549/GR對吉非替尼敏感性的影響，本文進行了裸鼠體內實驗。結果發現，miR-145-5p高表達減小裸鼠移植瘤腫瘤體積，減輕裸鼠移植瘤腫瘤重量，上調miR-145-5p mRNA表達，下調PAK4 mRNA表達，上升細胞凋亡率；共轉染pc-PAK4逆轉miR-145-5p高表達對A549/GR移植瘤作用。

綜上，miR-145-5p通過靶向PAK4促進A549/GR對吉非替尼的敏感性，為臨床治療非小細胞肺癌提供一種新的治療方法，但更為細致的分子通路機制還有待進一步研究。