LncRNA OSER1-AS1/miR-149-5p對口腔鱗癌細胞HSC-3生物學行為的影響

高磊 楊光 馮培 肖震 武家明 于浩

(齊齊哈爾市第一醫院口腔頜面外科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

口腔鱗癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，其發病率占全身腫瘤的3%，我國口腔鱗癌發病率逐年增加且已嚴重威脅人類生命安全，手術、放化療等技術水平的提高可明顯改善口腔鱗癌患者生存質量，而口腔鱗癌轉移是治療的關鍵問題，亦是影響患者預后的重要因素，因而探究口腔鱗癌發病機制對口腔鱗癌轉移的預防及治療均具有重要意義，長鏈非編碼RNA(LncRNA)在腫瘤中異常表達并可發揮重要調控作用，已有研究表明LncRNA在口腔鱗癌中差異表達，通過調節癌細胞生物學行為在癌癥進展中發揮重要作用〔1～4〕。LncRNA OSER1-AS1在肝細胞癌中呈高表達，并可通過調節miR-372-3p/Rab23軸促進肝細胞癌的發生〔5〕。靶基因預測顯示OSER1-AS1與miR-149-5p存在結合位點，miR-149-5p在胃癌中表達水平降低〔6〕。因此，本研究主要探討OSER1-AS1/miR-149-5p分子軸在口腔鱗癌發生及發展過程中的可能作用機制，為口腔鱗癌治療策略的發展提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1一般資料 43例從2018年2月至2019年10月在齊齊哈爾市第一醫院收治的口腔鱗癌患者被納入此次研究〔男32例，女11例，平均年齡(63.29±6.98)歲〕。口腔鱗癌患者均經病理確診。收集術中切除的癌旁及口腔鱗癌組織并置于-80℃保存。合并其他惡性腫瘤或者自身免疫性疾病患者被排除。

1.1.2細胞與主要試劑 上海冠導生物人口腔鱗癌細胞HSC-3；美國Gibco公司提供DMEM培養液、胎牛血清、胰蛋白酶；美國Invitrogen公司提供Trizol試劑與Lipofectamine2000；美國Hyclone公司提供Opti-MEM減血清培養基；美國Thermo Fisher公司提供反轉錄與SYBR熒光定量檢測試劑；廣州銳博生物提供si-NC、si-OSER1-AS1、miR-NC、miR-149-5p mimics、miR-149-5p inhibitor及其陰性對照(NC)；北京索萊寶提供MTT試劑與膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)試劑、基質膠；美國Corning公司提供Transwell小室；北京全式金生物提供RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒；美國Santa Cruz公司提供兔抗人B淋巴細胞瘤/白血病(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、鈣黏蛋白E(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(cadherin)抗體；北京中杉金橋生物提供辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗。

1.2方法

1.2.1實驗分組 將1×106個/ml對數生長期的HSC-3細胞接種于6孔板(200 μl/孔)，細胞進行轉染：采用Opti-MEM減血清培養基與si-NC、si-OSER1-AS1、si-OSER1-AS1與NC、si-OSER1-AS1與miR-149-5p inhibitor充分混合，將其置于室溫條件下孵育5 min作為A液，Lipofectamine2000轉染試劑和Opti-MEM減血清培養基充分混合作為B液，將A液與B液充分混合后置于室溫條件下孵育20 min，將混合液加入HSC-3細胞后于培養箱內繼續孵育6 h，棄上清后更換DMEM完全培養液繼續培養48 h，分別記為si-NC組、si-OSER1-AS1組、si-OSER1-AS1+NC組、si-OSER1-AS1+miR-149-5p inhibitor組。

1.2.2qRT-PCR 采用Trizol法提取組織及細胞總RNAs。檢測RNA濃度后，根據反轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA。應用美國ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀檢測OSER1-AS1(內參GAPDH)、miR-149-5p(內參U6)相對表達量。

1.2.3MTT檢測細胞存活率 收集各組HSC-3細胞后加入MTT試劑(20 μl/孔)，將其置于培養箱內繼續培養4 h后經3 000 r/min離心5 min棄上清，將二甲基亞砜(DMSO)加入其中(150 μl/孔)后室溫孵育1 h，檢測細胞相對吸光度值(OD 490 nm)并計算細胞存活率〔實驗組OD值/對照組OD值×100%〕。

1.2.4平板克隆形成實驗 收集各組HSC-3細胞(1×105個/ml)接種于6孔板(100 μl/孔)，將其置于培養箱內培養直至出現肉眼可見的細胞克隆團，用多聚甲醛(4%)固定細胞20 min，然后用結晶紫(1%)染色15 min。蒸餾水洗滌后，通過光學顯微鏡對菌落數(>50 個細胞)進行計數和拍照。

1.2.5流式細胞術 將各組HSC-3細胞重懸于100 μl結合緩沖液(1×)中，根據凋亡檢測試劑盒說明書用Annexin V-FITC(10 μl)和PI(5 μl)染色。通過流式細胞術對樣品進行分析。

1.2.6Transwell 將各組HSC-3細胞懸液(2×104細胞/200 μl無血清培養基)添加到Transwell 室上室中〔基質膠涂層(40 μl/孔)用于侵襲檢測和未涂層用于遷移檢測〕,并將500 μl添加有10%胎牛血清的培養基添加到下隔室中。24 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，通過膜的細胞用4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，然后顯微鏡觀察計數。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗 構建野生型(WT)或突變型(MUT)熒光素酶報告載體(WT/MUT-OSER1-AS1)。參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書分別將miR-NC、miR-149-5p mimics與WT-OSER1-AS1、MUT-OSER1-AS1共轉染入HSC-3細胞。48 h后，檢測熒光素酶活性。

1.2.8Western印跡檢測蛋白表達 采用500 μl RIPA裂解液提取各組HSC-3細胞的總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度后，30 μg蛋白樣品被10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離，并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋比1∶1 000的一抗稀釋液孵育24 h(4℃條件下)，隨后加入稀釋比為1∶5 000的二抗稀釋液孵育1 h(37℃)。TBST洗滌后，采用電化學發光(ECL)試劑盒檢測蛋白信號隨后應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1OSER1-AS1和miR-149-5p在口腔鱗狀細胞癌細胞中的表達 相較于癌旁組織，OSER1-AS1在口腔鱗癌組織中顯著升高(P<0.05)，而miR-149-5p的表達水平降低(P<0.05)，見表1。

2.2干擾OSER1-AS1對HSC-3增殖的影響 轉染si-OSER1-AS1后細胞活力顯著降低(P<0.05)且克隆形成數顯著減少(P<0.05)，而si-NC轉染不影響細胞增殖(P>0.05)。此外OSER1-AS1敲除導致miR-149-5p的表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖1、表2。

表1 OSER1-AS1和miR-149-5p的表達

表2 干擾OSER1-AS1對HSC-3細胞存活率、克隆形成及凋亡的影響

圖1 干擾OSER1-AS1對HSC-3克隆形成的影響

2.3干擾OSER1-AS1對HSC-3凋亡的影響 如表2、圖2、圖3所示，與si-NC組比較，si-OSER1-AS1轉染誘導細胞凋亡顯著增加(P<0.05)，并伴隨著Bax蛋白顯著升高，Bcl-2蛋白顯著降低(均P<0.001)。

2.4干擾OSER1-AS1對HSC-3遷移、侵襲及EMT的影響 相較于si-NC轉染，si-OSER1-AS1轉染顯著抑制細胞遷移及侵襲(P<0.05)，si-OSER1-AS1組細胞E-cadherin蛋白含量顯著升高(P<0.05)，N-cadherin蛋白含量顯著降低(P<0.05)，見圖4、圖5、表3。

1，2：si-NC組，si-OSER1-AS1組；圖3～5同圖2 干擾OSER1-AS1對HSC-3凋亡

圖3 凋亡蛋白表達

圖4 干擾OSER1-AS1對HSC-3遷移、侵襲(結晶紫染色，×200)

圖5 Western印跡檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達

表3 OSER1-AS1下調對HSC-3遷移、侵襲及EMT的影響

2.5OSER1-AS1和miR-149-5p靶向關系的驗證 圖6顯示miR-149-5p在OSER1-AS1的結合位點。 miR-149-5過表達明顯降低野生型OSER1-AS1報告載體的熒光素酶活性(P<0.05)，但不影響突變型(P>0.05)，見表4。

圖6 OSER1-AS1靶向miR-149-5p

表4 雙熒光素么報告實驗

2.6抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3增殖、凋亡的影響 與si-OSER1-AS1+NC組比較，si-OSER1-AS1+miR-149-5p inhibitor組細胞存活率顯著升高(P<0.05)，克隆形成數顯著增多(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖7～9、表5。

1,2:si-OSER1-AS1+NC組,si-OSER1-AS1+miR-149-5p inhibitor組；下圖同圖7 抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3凋亡的影響

圖8 抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3 克隆形成的影響

圖9 Bax、Bcl-2蛋白表達

表5 抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3細胞存活率、克隆形成和凋亡的影響

2.7抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3遷移、侵襲及EMT的影響 相較于si-OSER1-AS1+NC組，細胞遷移及侵襲的數量在si-OSER1-AS1+miR-149-5p inhibitor組顯著增多(P<0.05)，且E-cadherin蛋白含量顯著下降(P<0.05)，N-cadherin蛋白含量顯著升高(P<0.05)，見圖10、圖11、表6。

圖10 E-cadherin、N-cadherin蛋白表達

圖11 抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3遷移、侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

表6 抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3遷移、侵襲的影響

3 討 論

有研究表明LncRNA 在口腔鱗癌患者中異常表達，此外，環狀RNAs(circRNAs )差異表達可能通過充當miRNA競爭性內源RNA在口腔鱗癌的病理進展中起作用。例如，LncRNA LACAT1通過抑制miR-4301促進口腔鱗癌細胞增殖〔7〕。LncRNA HOXA11-AS通過抑制miR-214-3p表達而促進口腔鱗癌細胞增殖〔8〕。LncRNA人母系表達基因(MEG)3的低表達通過靶向miR-21促進口腔鱗癌的發展〔9〕。LncRNA膀胱癌相關轉錄本(BLACAT)1通過靶向miR-142-5p調節口腔鱗癌細胞的活力、遷移和侵襲〔10〕。LncRNA核旁斑組裝轉錄本(NEAT)1通過調控miR-365/G蛋白信號轉導調節因子(RGS)20在口腔鱗癌中促進細胞增殖和侵襲〔11〕。然而關于口腔鱗癌中OSER1-AS1表達，功能及機制的研究仍然較少。

有研究表明，OSER1-AS1通過競爭性結合miR-433-3p而促進Smad2的表達從而促進非小細胞肺癌的發展〔12〕。本研究結果顯示，口腔鱗癌組織中OSER1-AS1的表達水平高于癌旁組織，干擾OSER1-AS1表達能夠抑制口腔鱗癌細胞增殖及克隆形成能力。Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比值降低，即Bax的表達水平升高可通過線粒體凋亡途徑的激活促進細胞凋亡〔13〕。在本次實驗中，OSER1-AS1敲除可通過促進Bax的表達及抑制Bcl-2的表達顯著刺激口腔鱗癌細胞凋亡，提示干擾OSER1-AS1表達可促進口腔鱗癌細胞凋亡。EMT已被證明在腫瘤轉移中至關重要，其標志是 N-cadherin 上調及E-cadherin 的下調〔14〕。隨后本研究發現，OSER1-AS1下調抑制口腔鱗癌細胞遷移和侵襲能力及EMT過程。

為進一步探究OSER1-AS1在口腔鱗癌發生及發展過程中的作用機制，本研究證實OSER1-AS1與miR-149-5p存在靶向調控作用，其可負向調控miR-149-5p的表達。circ_0075341通過上調miR-149-5p的表達而促進宮頸癌的發展〔15〕。LncRNA前列腺癌相關轉錄本(PCAT)-1通過靶向miR-149-5p調節結直腸癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡〔16〕。LncRNA PCAT-1通過調節miR-149-5p/LRIG2軸促進非小細胞肺癌的進展〔17〕。在甲狀腺髓樣癌中上調miR-149-5可靶向抑制GIT1減弱癌細胞的侵襲和增殖〔18〕。circCTNNA1通過充當miR-149-5p的海綿分子并調節FOXM1表達而促進結直腸癌的進展〔19〕。LncRNA BLACAT1通過充當miR-149-5p的海綿分子并靶向驅動蛋白家族成員(KIF)2A而促進胃癌的發生〔20〕。本研究結果顯示，口腔鱗癌組織中miR-149-5p的表達水平低于癌旁組織，抑制miR-149-5p表達明顯削弱OSER1-AS1敲除對口腔鱗癌細胞生長以轉移的抑制作用。

綜上所述，下調口腔鱗癌細胞中OSER1-AS1的表達可通過升高miR-149-5p的表達從而抑制癌細胞生長和轉移，為口腔鱗癌的治療提供潛在靶標。但關于OSER1-AS1/miR-149-5p如何調控下游靶基因表達仍需進一步探究，仍需進行體內實驗進一步驗證OSER1-AS1/miR-149-5p分子軸在口腔鱗癌發生及發展過程中的作用機制。