circ-RAD23B通過miR-708-5p/CPNE1軸調控膀胱癌細胞增殖、細胞周期、凋亡的機制

鄭宏 曾振華 唐建生 王棟洋 李卿

(湘南學院附屬醫院泌尿外科，湖南 郴州 423000)

膀胱癌是全球常見的癌癥，靶向治療為一種療效確切且患者耐受性較好的新型治療模式，已在包括膀胱癌在內的多種實體惡性腫瘤的治療中有所應用〔1,2〕。研究表明circRNA可能在腫瘤發生、發展等方面發揮著重要調控作用，有望成為腫瘤診斷和治療的潛在靶標〔3〕。研究報道circ-RAD23B(circ_0087862)在非小細胞肺癌中過表達，與淋巴結浸潤、較低的分化等級和較短的總生存期有關；circ-RAD23B通過miR-593-3p/CCND2軸促進細胞生長，并通過miR-653-5p/淋巴瘤侵襲轉移誘導因子(TIAM)1途徑促進細胞侵襲〔4〕。circ_0087862下調通過靶向miR-1253/RAB3D軸顯著抑制了非小細胞肺癌體內腫瘤的生長，并增加了細胞凋亡〔5〕。然而circ-RAD23B對膀胱癌細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響及機制尚不清楚。circRNA可作為miRNA海綿吸附miRNA或與RNA相關蛋白結合形成復合物，進而調節基因轉錄等。研究報道miR-708-5p可能通過靶向細胞增殖上調因子(URGCP)抑制骨肉瘤細胞的增殖和侵襲〔6〕。miR-708-5p可靶向GAGE12I抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲〔7〕。LncRNA LOXL1-AS1通過調節miR-708-5p/轉錄因子(USF)1途徑促進胃癌的發生和發展〔8〕。此外，鈣離子依賴性磷脂結合蛋白(CPNE)1在三陰性乳腺癌組織和細胞系中過表達，并與患者的腫瘤大小，遠處轉移和存活率相關；敲低CPNE1可抑制腫瘤生長并促進細胞凋亡〔9〕。CPNE1沉默抑制人骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移〔10〕。而miR-708-5p、CPNE1對膀胱癌細胞的影響，兩者之間是否有調控作用及circ-RAD23B是否調控miR-708-5p、CPNE1表達也尚不清楚。本實驗探討circ-RAD23B是否通調控miR-708-5p和CPNE1影響膀胱癌細胞的增殖、細胞周期和凋亡。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2017年5月至2019年5月在湖南學院附屬醫院治療的49例膀胱癌患者，通過手術切除其癌組織及相應的癌旁組織；所有患者經病理檢測確診為膀胱癌，患者術前未進行過手術及放化療，患者均知情且同意。

1.2細胞與主要藥品試劑 人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1(貨號：HUCL-022，上海賽百慷生物技術股份有限公司)；膀胱癌細胞系T24(貨號：HT-X1609)、RT4(貨號：HT-X1607)、UM-UC-3(貨號：HT-X1610，深圳市豪地華拓生物科技有限公司)；RPMI1640培養基(貨號：CS-0018LS，上海莼試生物技術有限公司)；熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(貨號：XY-TE-0731)、蛋白提取試劑盒(貨號：XY-MY-1049)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(貨號：XY-MY-0096)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(貨號：XY-MY-0102)(上海烜雅生物科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號：YB11401ES60，上海鈺博生物科技有限公司)；噻唑藍(MTT)試劑盒(貨號：BJ-9721)、細胞周期檢測試劑盒(貨號：BJ-10637，上海邦景實業有限公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：BL10001-020，上海帛龍生物科技有限公司)。

1.3細胞處理與分組 人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1和膀胱癌細胞系T24、RT4、UM-UC-3用RPMI1640培養基培養，取對數生長期T24細胞，將si-NC、si-circ-RAD23B、miR-NC、miR-708-5p、si-CPNE1、pcDNA-NC、pcDNA-CPNE1轉染至T24細胞中，分為si-NC組、si-circ-RAD23B組、miR-NC組、miR-708-5p組、si-CPNE1組、pcDNA-NC組、pcDNA-CPNE1組；將si-circ-RAD23B 分別與pcDNA-NC、pcDNA-CPNE1共轉染至T24細胞中，分為si-circ-RAD23B+pcDNA-NC組、si-circ-RAD23B+pcDNA-CPNE1組；未轉染的正常培養T24細胞為NC組。

1.4實時熒光定量(RT-q)PCR檢測circ-RAD23B、miR-708-5p和CPNE1 mRNA表達水平 提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按照試劑盒說明進行PCR，循環條件為95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；相對表達量用2-△△Ct法計算。circ-RAD23B和CPNE1以GAPDH為內參，miR-708-5p以U6為內參；引物序列為circ-RAD23B上游：5′-TAGCGGATTCCCTGCTTGTC-3′，下游：5′-GGTGGGGGCTTGTCACATT-3′；CPNE1上游：5′-ACCCACTCTGCGTCCTT-3′，下游：5′-TGGCGTCTTGTTGTCTATG-3′；GAPDH上游：5′-CAGCGACACCC-ACTCCTC-3′，下游：5′-TGAGGTCCACCACCCTGT-3′；miR-708-5p上游：5′-GGCGCGAAGGAGCTTACAA-TCTA-3′，下游：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；U6上游：5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。

1.5Western印跡檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白后用BCA試劑盒進行定量；然后將蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉至聚偏氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育90 min，用電化學發光(ECL)發光液顯影，用Quantity One測定蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達水平為目的條帶和β-actin條帶灰度值的比值。

1.6雙熒光素酶報告實驗 構建含有miR-708-5p結合位點的circ-RAD23B和CPNE1的野生型(WT)及突變型(MUT)報告基因載體，將其與miR-708-5p mimics共轉染至T24細胞中，按試劑盒說明書檢測細胞熒光素酶活性。

1.7MTT檢測細胞增殖 收集各組培養48 h細胞，后每孔加入20 μl的MTT溶液，孵育4 h后加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩反應10 min，用酶標儀于波長490 nm處檢測吸光度(A)值。

1.8流式細胞術檢測細胞周期 收集各組培養48 h細胞，制備單細胞懸液，加入預冷的70%乙醇固定，洗滌后加入RNase A，37℃水浴30 min，加入碘化丙啶(PI)，4℃避光30 min，上機檢測激發波長488 nm處紅色熒光，用流式細胞儀和DNA細胞周期分析軟件對細胞周期進行檢測分析。

1.9流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組培養48 h細胞，加入10 μl的膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和PI，混勻后避光孵育10 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.10統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1在膀胱癌患者癌組織和癌旁組織中circ-RAD23B表達情況 與癌旁組織(1.00±0.10)比較，膀胱癌組織中circ-RAD23B表達水平(2.46±0.21)明顯升高(t=49.939；P<0.05)。

2.2在膀胱癌細胞系中circ-RAD23B、miR-708-5p、CPNE1表達情況 與SV-HUC-1比較，膀胱癌細胞系T24、RT4、UM-UC-3中circ-RAD23B表達及CPNE1 mRNA和蛋白表達水平明顯升高，miR-708-5p表達水平明顯降低(P<0.05)，見表1，圖1。

表1 在膀胱癌細胞系中circ-RAD23B、miR-708-5p、CPNE1表達情況

圖1 Western印跡檢測CPNE1蛋白表達

2.3circ-RAD23B 靶向miR-708-5p及miR-708-5p靶向CPNE1 Circinteractome預測顯示miR-708-5p和circ-RAD23B有結合位點；Targetscan預測顯示miR-708-5p和CPNE1結合位點(圖2)。miR-708-5p與circ-RAD23B或CPNE1-3′UTR WT報告質粒共轉染T24細胞后，細胞熒光素酶活性均降低(P<0.05)；miR-708-5p與circ-RAD23B或CPNE1-3′UTR突變型報告質粒共轉染T24細胞后，細胞熒光素酶活性均無顯著變化，見表2。

A：circinteractome對miR-708-5p和circ-RAD23B結合進行預測，B：Targetscan對CPNE1和miR-708-5p結合進行預測圖2 circ-RAD23B 靶向miR-708-5p及miR-708-5p靶向CPNE1

2.4低表達circ-RAD23B 對膀胱癌細胞T24增殖、細胞周期和凋亡及對miR-708-5p和CPNE1表達水平的影響 與si-NC組比較，si-circ-RAD23B組膀胱癌細胞T24中circ-RAD23B、CPNE1、CyclinD1表達水平及細胞A值、S期細胞所占比例明顯降低，miR-708-5p、Cleaved-caspase-3表達水平明顯升高，G2/M期細胞所占比例及細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，見表3，圖3、4、5。

2.5高表達miR-708-5p對膀胱癌細胞T24增殖、細胞周期和凋亡的影響及對CPNE1表達的影響 與miR-NC組比較，miR-708-5p組膀胱癌細胞T24中miR-708-5p、Cleaved-caspase-3表達水平及G2/M期細胞所占比例、細胞凋亡率明顯升高，CPNE1、CyclinD1表達水平及細胞A值、S期細胞所占比例明顯降低(均P<0.05)，見圖6、7、8，表4。

表2 miR-NC或miR-708-5p與circ-RAD23B和CPNE1-3′UTR WT及MUT報告質粒共轉染T24細胞后相對雙熒光素酶活性檢測結果

表3 低表達circ-RAD23B 對膀胱癌細胞T24增殖、細胞周期和凋亡及對miR-708-5p和CPNE1表達水平的影響

圖3 3組細胞凋亡流式圖

圖4 3組細胞周期流式圖

1～3：NC組，si-NC組，si-cire-RAD23B組圖5 Western印跡檢測3組CPNE1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

圖6 兩組細胞凋亡流式圖

圖7 兩組細胞周期流式圖

圖8 Western印跡檢測兩組CPNE1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

表4 高表達miR-708-5p對膀胱癌細胞T24增殖、細胞周期和凋亡及CPNE1蛋白表達的影響

2.6低表達CPNE1對膀胱癌細胞T24增殖、細胞周期和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-CPNE1組膀胱癌細胞T24中CPNE1、CyclinD1表達水平及細胞A值、S期細胞所占比例明顯降低，Cleaved-caspase-3表達水平、G2/M期細胞所占比例、細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，見表5，圖9、10、11。

表5 低表達CPNE1對膀胱癌細胞T24增殖、細胞周期和凋亡的影響

圖9 兩組細胞凋亡流式圖

圖10 兩組細胞周期流式圖

圖11 Western印跡檢測兩組CPNE1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

2.7高表達CPNE1可以逆轉circ-RAD23B 低表達對T24增殖、細胞周期的影響 與pcDNA-NC組比較，pcDNA-CPNE1組膀胱癌細胞T24中CPNE1、CyclinD1表達水平、細胞A值、S期細胞所占比例明顯升高，Cleaved-caspase-3表達水平、G2/M期細胞所占比例、細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與si-circ-RAD23B+pcDNA-NC組相比，si-circ-RAD23B+pcDNA-CPNE1組膀胱癌細胞T24中CPNE1、CyclinD1表達水平、細胞A值、S期細胞所占比例明顯升高，Cleaved-caspase-3表達水平、G2/M期細胞所占比例、細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，見表6，圖12、13、14。

表6 高表達CPNE1可以逆轉circ-RAD23B 低表達對T24增殖、細胞周期、凋亡的影響

圖12 4組細胞凋亡流式圖

圖13 4組細胞周期流式圖

1～4：pcDNA-NC組，pcDNA-CPNE1組，si-circ-RAD23B+pcDNA-NC組，si-circ-RAD23B+pcDNA-CPNE1組圖14 Western印跡檢測4組CPNE1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

3 討 論

研究報道，circRNA參與了膀胱癌的進展過程，可作為潛在預后生物標志物和治療靶標；如circACVR2A通過miR-626/EYA4軸抑制膀胱癌細胞增殖和轉移〔11〕。circ_0058063下調削弱了膀胱癌細胞的增殖和遷移能力，使細胞停滯在G0/G1期〔12〕。研究結果提示，circ-RAD23B可能在膀胱癌中起促癌作用。本研究結果表明，抑制circ-RAD23B表達可抑制膀胱癌細胞T24增殖、阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡。

本實驗發現circ-RAD23B靶向調控miR-708-5p的表達。研究報道miR-708-5p可誘導骨肉瘤細胞凋亡，且通過靶向鋅指E盒同源結合蛋白(ZEB)1來抑制遷移〔13〕。抑制微小染色體維持蛋白3相關蛋白(MCM3AP)-AS1可通過上調miR-708-5p抑制胃癌MGc-803和SGC-7901細胞增殖并增強其凋亡〔14〕。抑制MINCR可通過上調miR-708-5p抑制結腸癌細胞增殖和遷移〔15〕。本研究結果表明miR-708-5p高表達可抑制膀胱癌細胞T24增殖，促進細胞凋亡。提示miR-708-5p在膀胱癌中可能起抑癌基因作用。

本研究通過在線軟件預測miR-708-5p的可能靶mRNA，發現miR-708-5p可結合CPNE1。研究報道CPNE1高表達促進人肺腺癌細胞生長和轉移〔16〕。CPNE1基因被沉默能夠顯著抑制MDA-MB-231細胞的增殖能力〔17〕。miR-195-5p過表達可通過直接靶向CPNE1抑制非小細胞肺癌衍生細胞的增殖、遷移和侵襲〔18〕。本研究結果表明，膀胱癌細胞系T24、RT4、UM-UC-3中CPNE1 mRNA和蛋白表達水平升高；抑制CPNE1 表達可抑制膀胱癌細胞T24增殖，促進細胞凋亡。且miR-708-5p靶向調控CPNE1。此外，高表達CPNE1逆轉了circ-RAD23B 低表達對T24細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響。

綜上，circ-RAD23B低表達可能通過miR-708-5p/CPNE1軸抑制膀胱癌細胞增殖，誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡。