基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術檢測支氣管肺泡灌洗液對涂陰或無痰肺結核的診斷價值

侯婧 王華 劉盛盛

安徽省胸科醫院結核科（合肥 230022）

肺結核（PTB）是威脅人類健康的世界性公共衛生問題［1］。我國2020年結核發病人數約84.2 萬人，居全球第二，結核病負擔較重［2］。傳統的痰液抗酸染色能夠快速診斷結核病，但其陽性率小于30%，且部分患者無痰或留取痰液標本不規范，也影響了診斷率。這部分無痰或涂片陰性（涂陰）的PTB 患者約占總數的70%，快速、準確的對其做出診斷，對降低病死率、改善預后、控制結核傳播至關重要，是目前結核病防治的重要任務［3］。臨床常用支氣管肺泡灌洗液（BALF）檢測以克服影響痰液標本采集的諸多影響因素，提高疾病診斷率［4］。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法（MALDI-TOF MS）是一種新型細菌鑒定技術，其準確性高、操作便捷、成本低廉，近年來已逐漸應用于臨床多種病原微生物的鑒定［5-7］。但該技術對涂陰或無痰PTB 的BALF 檢測診斷價值研究尚未見報道。本研究運用MALDI-TOF MS 對安徽省胸科醫院收治的87 例涂陰或無痰疑似PTB 患者BALF 進行檢測，探究其診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2020年1月至2021年12月安徽省胸科醫院住院診療的87 例涂陰或無痰的疑似PTB 患者為研究對象。納入標準：（1）胸部影像學檢查疑似PTB；（2）痰抗酸染色至少連續3 次陰性或無痰；（3）無纖維支氣管鏡檢查禁忌，且同意該檢查；（4）同意BALF 送檢MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert 檢測以及BD960 培養。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準

1.2.1 涂陰或無痰肺結核診斷本研究中診斷標準參考《WS288-2017 肺結核診斷標準》［8］制定，3 次痰涂片陰性或無痰，胸部影像學符合PTB 改變，且符合下列條件之一：（1）有咳嗽、咳痰、咯血等結核可疑癥狀；（2）皮膚結核菌素試驗陽性或強陽性，或γ-干擾素釋放試驗陽性，或結核抗體陽性；（3）經診斷性抗結核藥物治療且隨訪觀察有效者。

1.2.2 其他肺部疾病的診斷參照第九版《內科學》中呼吸系統疾病章節［9］，臨床診斷為其他肺部疾病者。

1.3 BALF 收集方法患者于我院內鏡中心行氣管鏡檢查采集BALF，應用奧林巴斯BF1T206 纖維支氣管鏡，在胸部CT 提示病灶相應的支氣管肺段注入0.9%NaCl 10～20 mL進行灌洗，負壓吸引回收BALF 至無菌瓶。送我院檢驗科行SAT-TB、Gene-Xpert 檢測及BD960 培養，上海康黎公司行MALDITOF MS 檢測。

1.4 BALF檢驗方法（1）MALDI-TOF MS：應用美國Agena 核酸質譜分析系統MassARRAY 進行檢測，先對BALF 常規生物滅活，配置反應液5 μL，進行PCR 引物擴增，后去除脫氧核糖核苷三磷酸，再進行檢測位點的單堿基延伸反應，經處理后檢測。（2）SAT-TB：采用上海仁度生物科技有限公司試劑盒，提取約2 mL 標本經處理后超聲破碎15 min，取標本于恒溫熒光檢測儀上檢測。（3）Gene Xpert：設備和試劑盒由美國Cepheid 公司生產，標本經消化等處理，儀器自動進行過濾和洗滌，超聲溶菌并釋放出DNA 后與PCR 反應試劑混合并檢測。（4）BD960：采用美國BD 公司BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養儀，標本處理后接種于分枝桿菌培養瓶中進行液體培養［10］。

1.5 統計學方法采用SPSS 13.0 統計軟件對數據進行統計分析，一般資料比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。各檢驗方法的診斷效能，如敏感性等比較采用χ2檢驗及事后兩兩比較。運用Medcalc 19.0.4 繪制受試者工作特征（ROC）曲線，以曲線下面積（AUC）評估不同檢測方法的診斷價值，并采用Delong 法進行比較。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料87 例疑似PTB 患者納入研究。根據最終診斷，結核組共54 例，男27 例，女27 例，年齡16～72 歲。其他肺部疾病組共33 例，男19 例，女14 例，年齡22～74 歲。兩組患者的性別、年齡、癥狀等一般資料見表1。

表1 87 例疑似肺結核患者的一般資料Tab.1 Profiles of 87 patients with suspected pulmonary tuberculosis例

2.2 4 種檢測方法的診斷效能MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert 及BD960 法診斷特異性均＞95.0%；敏感性分別為68.5%（37/54）、13.0%（7/54）、40.7%（22/54）和27.8%（15/54）；陽性預測值分別為97.4%（32/33）、87.5%（7/8）、100.0%（22/22）和100.0%（15/15）；陰性預測值分別為65.3%（32/49）、40.5%（32/79）、50.8%（33/65）和45.8%（33/72）。4 種檢測方法的敏感性差異有統計學意義（χ2=38.459，P＜0.001），兩兩比較發現MALDI-TOF MS 診斷的敏感性優于SAT-TB、Gene-Xpert 和BD960 法（P＜0.05）。見表2。

表2 4 種檢測方法對涂陰或無痰肺結核的診斷效能Tab.2 The diagnostic efficacy of four testing methods for smear-negative or sputum-scarce pulmonary tuberculosis

2.3 4 種檢測結果ROC 曲線分析進一步采用ROC 曲線對各檢測方法的診斷效能進行評價。MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert 及BD960 法的AUC值分別為0.827、0.550、0.704和0.639。MALDI-TOF MS 法的AUC 值最高，明顯優于其他3 種檢測方法（Z=8.139、3.608 和5.097，均P＜0.01），見圖1。

圖1 4 種檢測方法ROC 曲線分析Fig.1 ROC curves of four testing methods

2.4 MALDI-TOF MS 法與其他方法的聯合診斷效能MALDI-TOF MS 法分別與SAT-TB 法、Gene-Xpert 法和BD960 法聯合診斷的AUC 為0.836、0.834 和0.832。聯合診斷方法與單一MALDI-TOF MS法AUC的差異均無統計學意義（Z=0.993、0.987和0.976，P=0.32、0.32和0.33），見圖2。

圖2 MALDI-TOF MS 法與其他方法的聯合診斷的ROC曲線分析Fig.2 ROC curves of joint diagnosis by combining MALDITOF MS with other methods

3 討論

目前臨床上對涂陰或無痰PTB 缺少快速、簡便、有效的檢測方法。分枝桿菌培養是其診斷的“金標準”，但耗時2～6 周，且受接種技術、培養基質量、孵化時間等多因素影響，不能滿足臨床早期、高效診斷的需求［11］。近年來分子檢測技術逐步應用于PTB 診斷，提高了早期診斷率［12］。常見方法包括RNA 恒溫擴增實時熒光檢測（SAT-TB）、結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測（Gene-xpert），但其對于涂陰結核的診斷率仍較低，且操作繁瑣、實驗室要求高，難以滿足臨床需求［13-14］。

MALDI-TOF MS 是一種新型軟電離生物質譜，其原理是在基質輔助下使結合后的分子發生電離，在電場作用下加速通過飛行管道，根據到達檢測器的時間不同進行鑒別。從激光發射到信號檢測的過程只需幾毫秒，故可在不到50 min 的時間內對384 個樣本進行分析。這種對復雜生物樣本中的痕量核酸進行的檢測，具有通量高、速度快、成本低的特點［15］。美國Agena Bioscience 公司MassARRAY@MALDI-TOF MS 于2018年被批準用于臨床核酸檢測，其不依賴于熒光探針和熒光類試劑的檢測流程，克服了PCR 技術多重擴增能力不足的問題，解決了基因組檢測中多個變異位點同時檢測的需求［16］，且檢測周期遠低于傳統的一代、二代測序（≥18 h），對少量標本也能夠進行多基因多位點的檢測［17-19］，滿足了臨床檢測的需求。

已有不少研究證實該技術檢測結核菌的準確性：CAO等［20］對國內外19項MALDI-TOF MS分枝桿菌鑒定研究進行Meta分析，涉及2 593株分離株，發現MALDI-TOF MS 鑒定結核菌的符合率為92%。有研究比較了MALDI-TOF MS、核酸雜交和MTB64免疫分析試驗鑒定結核菌和非結核分枝桿菌的效果，MALDI-TOF MS 鑒定的符合率為88%，且鑒定時間僅需45 min，而核酸雜交需要6～7 h［21］。LUO等［22］的研究中，MALDI-TOF-MS 對507 株分枝桿菌分離株進行鑒定，正確率達到93.9%。但該技術檢測涂陰或無痰PTB 患者BALF 標本的臨床研究未見報道。臨床工作中許多疑似肺結核患者，反復查痰涂片陰性，或在醫師指導下仍無法留取合格的痰液標本，故本研究采用BALF 為研究標本，分別進行MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert 檢測以及BD960 培養。結果發現，以臨床診斷為標準，以上各方法均具有極佳的診斷特異性。MALDITOF MS敏感性為68.5%（37/54），明顯高于SAT-TB、Gene-Xpert 及BD960 的13.0%（7/54）、40.7%（22/54）及27.8%（15/54）。考慮其利用了多重PCR 技術，在同一個反應中可同時檢測高達40個變異位點，且基于分子量的質譜檢測方式提供了不依賴于熒光信號的檢測準確度，大大提高了檢測效能。

本研究中仍有31.5%的患者核酸質譜檢測為陰性，考慮可能是：（1）BALF 中的結核菌量過少，經擴增后仍無法達到檢測所需量；（2）其檢測敏感度標準菌株質譜圖庫尚不能覆蓋所有分枝桿菌。以上原因可能導致了MALDI-TOF MS的檢測結果與臨床診斷不一致。通過多次灌洗提高BALF 菌量，或自建臨床菌株質譜圖庫，增加質譜圖庫范圍，可進一步提高MALDI-TOF MS 的菌種鑒定能力。而在33 例非結核患者中僅有1 例MALDI-TOF MS 陽性，經臨床分析考慮為假陽性，其特異性為97.0%，提示該方法診斷PTB 具有高度準確性。產生假陽性的可能原因分析如下：（1）在BALF 分裝送檢、支氣管鏡消毒或實驗室操作過程中造成污染所致；（2）對近緣菌株的分辨率有限，偶有少量菌株被誤判為結核分枝桿菌。提示在支氣管鏡消毒、BALF留取、標本分裝及送檢、實驗室操作環節中應嚴格各項操作規范，避免人為因素而出現假陽性。

本研究中，MALDI-TOF MS、SAT-TB、Gene-Xpert和BD960 法的AUC 值分別為0.827、0.550、0.704 和0.639。其AUC 值優于其他3 種檢測方法。進一步采用ROC 曲線分析了MALDI-TOF MS 分別聯合其他3 種檢測方法的診斷效能，發現MALDI-TOF MS單獨診斷涂陰或無痰PTB 的AUC 和聯合診斷的AUC 相比均無明顯差異。這說明臨床上可單獨采用MALDI-TOF MS 法進行輔助診斷，避免聯合多種檢測手段帶來的醫療資源消耗。

綜上所述，MALDI-TOF MS 法對涂陰或無痰PTB 具有較好的輔助診斷價值和臨床應用前景。本研究存在一定局限性，為單中心、小樣本的研究，且樣本量有限。今后可考慮多中心、大樣本研究，以進一步驗證其診斷價值。并擴大標本類型，如胸腔積液、膿液、腦脊液等，探索該技術對肺外結核的診斷價值。