鼠李糖乳桿菌及姜黃素通過調節TLR4信號通路對代謝相關脂肪性肝病影響的研究

徐子媛 張九娜 孟燦燦 程燕 郭永澤 李校天

1河北工程大學臨床醫學院（河北邯鄲 056000）；2河北工程大學附屬醫院（河北邯鄲 056000）

代謝相關脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）曾經被稱為非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）［1］，是全球各地肝病相關死亡的重要原因［2］。近年來隨著生活方式和飲食習慣的改變，該病的發病率持續升高［3］，全球患病率為25.54%［4］，已經成為了全球普遍關注的醫學和社會問題。從“一次打擊”學說到“多次打擊”學說，MAFLD 的發病機制尚未完全闡明，目前普遍接受的是“多次打擊”學說［5］，它的核心因素包括脂質代謝紊亂、胰島素的抵抗和氧化應激反應［6］。隨著研究的深入，先天免疫的活化在MAFLD 進展中的作用被證實，Toll 樣受體途徑是其中關鍵的一環［7］，TLR4 信號通路可以誘導炎癥、介導氧化應激，在MAFLD 的發病機制中起到了關鍵性作用。除干預飲食及生活方式外，目前臨床尚無MAFLD 的國際批準治療藥。故本實驗通過研究鼠李糖乳桿菌及姜黃素對MAFLD 模型形成過程中TLR4 信號通路的影響，探討MAFLD形成的調節控制因素及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物SPF 級SD 雄性大鼠40 只，8～12 周齡，體重（160±20）g，由濟南彭越實驗動物繁育公司提供。分籠飼養于溫度及濕度適宜的情況下，不限制飲食和水，動物處置過程嚴格遵守河北工程大學醫學院生物醫學倫理委員會的規定。

1.1.2 藥品與試劑鼠李糖乳桿菌凍干粉購于鄭州百益寶生物技術銷售部，姜黃素羧甲基纖維素鈉購于大連美倫生物技術有限公司。所有藥物均置于4℃冰箱冷藏，每日灌胃前新鮮配制。脂多糖（LPS）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒，均購于杭州聯科生物技術有限公司。Toll 樣受體4（TLR4）、核因子-κBp65（NF-κBp65）、MyD88 和β-Actin 內參抗體，均購于美國Santa 公司。

1.1.3 儀器全自動生化儀，美國貝克曼有限公司產品；酶標儀，賽伯樂儀器有限公司產品；蛋白電泳儀，美國伯樂公司產品；

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠分組40 只SD 雄性大鼠適應性喂養一周后隨機分為5 組：正常對照組（MCS）、模型對照組（MCD）、鼠李糖乳桿菌干預組（LGG）、姜黃素干預組（CUR）、鼠李糖乳桿菌聯合姜黃素干預組（LGG+CUR），每組8 只。

1.2.2 大鼠MAFLD 模型建立及干預模型對照組大鼠飼以蛋氨酸膽堿缺乏（methionine-cholinedeficient diet，MCD）飼料，該模型主要用于NAFLD治療藥物的篩選［8］，正常對照組大鼠飼以蛋氨酸膽堿充足（methionine-choline-suffficient diet，MCS）飼料。各干預組在MCD 飲食的基礎上，LGG 組每日以鼠李糖乳桿菌2.0×1010CFU/100 g/d 劑量溶液灌胃一次，CUR 組每日以姜黃素200 mg/（kg·d）劑量溶液灌胃一次，LGG+CUR 組每日以鼠李糖乳桿菌2.0 × 1010CFU/100（g·d）劑量溶液聯合姜黃素200 mg/（kg·d）劑量溶液灌胃一次。正常對照組和模型對照組每日同等量的蒸餾水灌胃。溶液為鼠李糖乳桿菌凍干粉、姜黃素和無菌蒸餾水現配現用。

1.2.3 標本收集、處理和肝指數計算連續喂養4 周，每日觀察大鼠的進食、活動、生長、毛色等情況。造模結束后，次日清晨稱重，用100 g/L（10%）水合氯醛溶液0.5 mL/100 g 腹腔注射麻醉后，門靜脈取血，以4 000 r/min 離心5 min。血清分裝于1.5 mL 的離心管中，置于超低溫冰箱中保存備用；同時取出新鮮完整肝臟，去除肝臟包膜，迅速稱肝濕重，計算肝指數。另切取肝左葉的肝組織數塊，置于4%多聚甲醛液，做上標記，其余置于超低溫冰箱中保存，用于RT-PCR、Western-blot 等檢測。肝指數=肝濕重（g）/體重（g）×100%。

1.2.4 HE 染色法觀察肝組織病理形態將切片放入二甲苯（Ⅰ、Ⅱ溶液，各20 min），再放入無水乙醇（Ⅰ、Ⅱ溶液，5 min），入75%酒精中5 min，自來水沖洗。隨后入蘇木素染液染5 min，自來水沖洗，分化液分化，自來水沖洗，返藍，流動水洗。入85%、95%的酒精，各5 min。入伊紅染液5 min。依次放入無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和二甲苯Ⅰ、Ⅱ中，各5 min，進行脫水透明。采用中性樹膠封片后，光學顯微鏡觀察，采集圖像。

1.2.5 全自動生化分析儀測血清轉氨酶及肝臟脂肪含量用全自動生化分析儀測大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、肝甘油三酯（liver triglycerides，TG）、肝膽固醇（liver cholesterol，TC）水平。

1.2.6 酶聯免疫吸附法測血清炎性因子用酶聯免疫吸附法（ELISA）法測定血清中脂多糖（LPS）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量，按照試劑盒提供的說明書嚴格進行。

1.2.7 RT-PCR 法測TLR4、NF-κBp65 和MyD88基因的表達量取大鼠肝組織100 mg，Trizol 法提取組織RNA，具體步驟按照試劑盒說明書操作，NanoDrop?ND-2000 儀器檢測提取RNA 的濃度及質量，利用Prime-Script?RT Enzyme Mix 試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA，加入擴增反應體系運用實時熒光定量PCR 法擴增，40 個循環反應結束后用2-ΔΔCt法進行相對定量分析，檢測基因mRNA 相對表達水平。以為β-Actin為內參，引物序列見下表。

1.2.8 蛋白質印跡法測TLR4、NF-κBp65和MyD88蛋白的表達量取大鼠肝組織100 mg，提取細胞總蛋白，各取60 μg 進行凝膠電泳，半干轉移法轉膜、5%脫脂牛奶封閉、一抗封閉和二抗封閉后，用增強化學發光法曝光，顯影、定影和沖洗晾干后，掃描儀掃描蛋白條帶。以β-Actin 為內參，以所測蛋白的灰度值/β-actin 的灰度值的比值為所測蛋白的相對表達量。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence list

1.3 統計學處理采用統計學軟件SPSS 26.0 進行數據分析與整理，測量數據以（±s）表示。5 組間比較采用單因素ANOVA 分析，5 組間兩兩比較時采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況所有大鼠實驗過程中均沒有死亡，MCS組大鼠飲食良好，靈敏好動，毛發光潔；MCD組大鼠飲食減退，體重下降，反應遲鈍，毛發灰暗；LGG組、CUR組、LGG+CUR組大鼠一般情況較MCD組有所改善，LGG+CUR組一般情況接近MCS 組。

2.2 肝指數比較MCD 組大鼠較MCS 組肝指數明顯升高，兩組間比較差異有統計學意義（P＜0.01）；各干預組與MCD 組比較，肝指數均不同程度降低，聯合組降低最顯著，差異均有統計學意義（P＜0.01），提示鼠李糖乳桿菌、姜黃素均可改善MAFLD 模型大鼠的肝指數，兩者聯合效果更佳。見表2。

表2 5 組大鼠肝指數的比較Tab.2 Comparison of the liver index in 5 groups of rats x±s

2.3 肝組織病理學變化比較正常對照組大鼠的肝小葉結構完整，細胞核分布均勻，且肝細胞大小一致；模型組大鼠出現明顯的彌漫性的肝細胞脂肪變性，細胞核大小不一；各干預組與模型組比較，均有不同程度的脂肪細胞浸潤，且脂肪變性程度和脂肪空泡數量均呈不同程度減少，見圖1。

圖1 顯微鏡下大鼠肝組織病理學變化比較（×200）Fig.1 Comparison of the pathological changes of liver tissue under microscope（×200）

2.4 血清轉氨酶及肝臟脂肪水平比較與MCS組比較，MCD 組大鼠血清ALT、AST、肝組織TG、TC明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）；各干預組與MCD 組比較，血清ALT、AST、肝組織TG、TC 均有不同程度的降低，其中以LGG+CUR組最為明顯，差異均有統計學意義（P＜0.01）。該研究結果提示鼠李糖乳桿菌及姜黃素均可顯著改善MAFLD 模型大鼠肝功能、降低肝臟脂肪沉積，兩者聯合應用效果更佳。見表3。

表3 大鼠ALT、AST 和肝臟RG、TC 水平Tab.3 Serum ALT，AST and liver TG levels in rats x±s

2.5 血清炎性因子水平比較模型組與對照組相比，LPS、IL-6 和TNF-α 均明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.01）。鼠李糖乳桿菌組、姜黃素組及鼠李糖乳桿菌聯合姜黃素組與模型組相比，LPS、IL-6 和TNF-α 均不同程度降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）。提示鼠李糖乳桿菌、姜黃素均可降低MAFLD 大鼠炎性因子水平。見表4。

表4 大鼠LPS、IG-6 和TNF-α 水平Tab.4 Levels of the LPS，IL-6 and TNF-α in rat serue x±s

2.6 肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 基因的表達比較MCD 組大鼠與MCS 組相比，肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 基因的相對表達均明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；各干預組與MCD 組相比，TLR4、NF-κB 和MyD88 基因的相對表達的表達均不同程度降低，聯合組降低最明顯，差異均有統計學意義（P＜0.01）；提示鼠李糖乳桿菌、姜黃素均可降低MAFLD 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 基因表達水平，且兩者聯合應用效果更佳。見表5。

表5 大鼠肝組織MyD88、NF-κB 和TLR4 的相對表達量Tab.5 The relative expression of MyD88、NF-κB and TLR4 genes in rat liver tissue ±s

表5 大鼠肝組織MyD88、NF-κB 和TLR4 的相對表達量Tab.5 The relative expression of MyD88、NF-κB and TLR4 genes in rat liver tissue ±s

注：MCD 與MCS 組比較，*P＜0.01；干預組與MCD 組比較，#P＜0.01；與CUR+LGG 組比較，▲P＜0.01

組別MCS MCD CUR LGG CUR+LGG MyD88 mRNA 0.92±0.12 3.41±0.23*2.38±0.12#▲2.38±0.13#▲1.57±0.14#NF-κB mRNA 1.05±0.07 3.17±0.10*2.19±0.09#▲2.20±0.09#▲1.81±0.06#TLR4 mRNA 1.06±0.09 3.38±0.16*2.37±0.15#▲2.40±0.15#▲1.79±0.10#

2.7 肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白的表達比較MCD 組大鼠與MCS 組相比，肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白的相對表達均明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；各干預組與MCD 組相比，TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白的相對表達的表達均不同程度降低，聯合組降低最明顯，差異均有統計學意義（P＜0.01）；提示鼠李糖乳桿菌、姜黃素均可降低MAFLD 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白表達水平，且兩者聯合應用效果更佳。見表6、圖2。

表6 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 的表達量Tab.6 The different expression of MyD88，NF-κB and TLR4 liver tissue ±s

表6 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 的表達量Tab.6 The different expression of MyD88，NF-κB and TLR4 liver tissue ±s

注：MCD 組與MCS 組比較，*P＜0.01；干預組與MCD 組比較，#P＜0.01，與CUR+LGG 組比較，▲P＜0.01

組別MCS MCD CUR LGG CUR+LGG MyD88 蛋白0.93±0.09 3.24±0.19*2.64±0.19#▲2.67±0.11#▲1.56±0.18#NF-κBp65 蛋白1.04±0.28 3.05±0.19*2.49±0.17#▲2.48±0.23#▲1.53±0.07#TLR4 蛋白0.82±0.05 2.66±0.09*2.06±0.04#▲1.96±0.09#▲1.37±0.10#

圖2 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白的表達Fig.2 The different expression of TLR4、NF-κB p65 and MyD88 in liver tissue

3 討論

TLR 是免疫系統中發現最早的模式識別受體（PRR），在固有免疫應答中識別病原微生物的病原相關的分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），激活先天性免疫應答，還引起細胞因子的釋放［9］。TLR 廣泛分布于肝細胞、庫普弗細胞、肝星狀細胞、肝竇內皮細胞和膽管內皮細胞，其表達與PAMP的刺激有關［10］。常見的與代謝相關性脂肪性肝病有關的TLR 包括TLR2、TLR4、TLR5、TLR9，它們的配體分別是肽聚糖、脂多糖、鞭毛蛋白和細菌DNA［11-13］。TLR 介導的信號主要通過兩種途徑轉導，即“蛋白髓樣分化因子（MyD88）依賴性途徑”和“MyD88 非依賴性途徑”［14］。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性桿菌細胞壁外層的主要成分，也稱內毒素，是肝損傷中的一個重要因子，它能激發機體引起強烈的炎癥反應［15］。TLR4 是LPS的模式識別受體，表達于各種肝臟細胞中，通過MyD88 依賴途徑與LPS 結合并激活核因子-κB（NF-κB）通路，它的激活導致許多促炎、抗病毒，抗菌因子的產生［7］。實驗［16］發現，TLR4 基因缺陷和肝臟庫普弗細胞失活都能夠使高脂肪飲食誘導的NAFLD 模型小鼠肝臟功能障礙減輕，表明肝臟庫普弗細胞上TLR4 的表達是NAFLD 疾病進程的重要因素。TLR 信號在健康肝臟中被抑制，但是當病原微生物和細菌來源的分子被輸送到肝臟時被激活，產生抗菌和抗病毒細胞因子，如TNF-α、IL-β和干擾素［17］，這些細胞因子持續升高會損傷肝細胞。研究［18］證明在有NASH 的小鼠中，LPS 血清水平與對照小鼠相比有所增加，并且與核因子激活相關，使用TLR4 抑制劑治療導致患有NASH 的小鼠肝炎癥降低。所以，通過對TLR4 轉導途徑的合理干預，能夠對MAFLD產生改善作用。

益生菌可以調節腸道菌群，增加腸道有益細菌，減少有害細菌［19］。乳酸桿菌GG（LGG）是益生菌常用的菌株［20］，因為這些細菌可以通過產生乳酸和其他抗菌物質來抑制革蘭氏陰性致病菌的擴張［21］。LGG 已被證明可以激活轉錄因子NF-κB，它是先天免疫反應的中心激活劑之一［22］。補充益生菌有望逆轉腸道微生物群的表型，從而改善健康狀況［23］。姜黃素（Curcumin）是從姜黃（Curcuma longa）根莖中分離出來的一種天然多酚類化合物［24］。它有許多生物活性，包括抗氧化、抗病毒、抗炎和抗菌［25］。實驗［26］證明，姜黃素通過各種細胞信號通路對氧化應激相關肝病表現出預防和治療作用。

本實驗采用蛋氨酸膽堿缺乏飲食建造MAFLD大鼠模型，以姜黃素及鼠李糖乳桿菌進行干預，通過觀察姜黃素、鼠李糖乳桿菌及兩者聯合對MAFLD大鼠的治療效果，檢測大鼠血清LPS、TNF-α、IL-6 及肝組織TLR4、NF-κBp65、MyD88 表達量，來探討潛在作用機制。蛋氨酸膽堿缺乏飲食促進MAFLD發生發展的主要機制為：一為極低密度脂蛋白（VLDL）合成減少和向外周分泌的減少，二為蛋氨酸與膽堿缺乏使抗氧化劑合成減少［14］。在本研究中，經姜黃素及鼠李糖乳桿菌干預后，大鼠肝細胞脂肪變均有減輕，各干預組肝細胞結構排列更加整齊，脂滴減少，肝指數下降，血清轉氨酶及炎性因子水平降低，肝甘油三酯及肝組織TLR4、NFκBp65、MyD88 的表達下調。上述結果表明，鼠李糖乳桿菌及姜黃素可減輕MAFLD 大鼠肝損傷及脂質沉積，可能與調節TLR4 信號通路，降低TLR4通路下游的炎性因子的表達有關，有望為MAFLD臨床治療提供一種新的治療選擇。